南药巴戟天脱毒苗的培育与快繁体系的优化

陈子恩　冯 冲　罗振华　刘梦云 丁平

关键词：巴戟天；脱毒；快繁；直接器官发生；病毒检测

中图分类号：R285 文献标识码：A

巴戟天（Morinda officinalis How）为茜草科巴戟天属植物，多年生藤本，其干燥根入药，是我国的“四大南药”之一，具有补肝肾、强筋骨的作用[1]。其主产于广东、福建等地，在我国主要通过扦插繁殖，病毒通过植物的无性繁殖在植物体内传递及积累，最终造成植物生长受到抑制、产量及品质下降[2-3]，因此，加强对巴戟天组织培养技术的研究具有十分重要的意义。本课题组在前期研究中对花叶病巴戟天进行病原鉴定，确定该病原为黄瓜花叶病毒-巴戟天株（Cucumbermosaic virus isolate Morinda officinalis How，CMVMO）[4]。目前，对于防治病毒病害没有特别有效的防治药物，脱除病毒是提高植物产量和品质最有效的方法，张晓丽等[5]发现脱毒苗在生长过程中各方面指标如形态指标、生理特性均优于非脱毒苗，且产量也会显著提高。常见的脱病毒方法包括低温脱毒、温热脱毒、利用组织培养技术脱毒、化学脱毒等[6]。其中，利用组织培养技术脱除植物病毒简便、易行，目前使用该技术进行植物脱毒的有半夏（Pinellia ternata）、大蒜（Allium sativum）、姜（Zingiber officinale Rosc.）等[7-9]。因此，加强对巴戟天组织培养技术的研究具有十分重要的意义。

通过器官发生途径进行组织培养是药用植物组织培养的主要方式，指一定条件下通过诱导外植体产生不定芽等器官，经过扩繁、诱导生根、炼苗移栽等步骤发育成为完整植株。器官发生途径有2 种，根据组织培养过程中是否需要诱导愈伤组织，又分为直接器官发生途径和间接器官发生途径[10]。目前巴戟天的组织培养技术主要通过间接器官发生途径，即利用巴戟天外植体诱导出愈伤组织，通过愈伤组织诱导不定芽从而获得巴戟天的组培苗，这种组织培养方法存在许多问题，例如培养时间比较长，培养基配方繁多，繁殖系数低，増殖困难，继代生长周期长，缺少建立经济效率高、成本低的标准化生产体系等。与其相比，直接器官发生途径不需经过愈伤组织阶段，周期更短，且期间发生的变异少，能很好地保留植株的遗传特异性，特别适用于需要维持遗传稳定性的道地药材种苗的培育[11-13]。利用直接器官发生途径建立巴戟天组织培养技术体系的研究迄今鲜有报道。故本研究选用组织培养技术以获得巴戟天的脱毒苗，通过直接器官发生途径，以巴戟天茎段材料直接诱导生芽，建立巴戟天的组织培养技术体系的快速繁殖方法，为巴戟天种苗的工厂化生产提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

巴戟天小叶黑蕊型植株与大叶型植株均收集自广东省德庆县，移栽至华南植物园种质资源圃。经广州中医药大学丁平研究员鉴定为茜草科植物巴戟天的植株。

1.2 方法

1.2.1 外植体的消毒接种 取两年生的巴戟天样品，将其茎分为3 部分，距离顶端20 cm 以内为幼嫩茎段，距离顶端20～40 cm 处为半木质化茎段，距离顶端超过40 cm 的部位为完全木质化茎段。切除叶片后置于超净工作台中，用75%酒精棉片，擦拭其表面，将巴戟天茎段切成带有节位的长度约为2～3 cm 的小段，为了筛选出巴戟天的最佳消毒部位和消毒方法，将其使用0.1%氯化汞将巴戟天幼嫩、半木质化及木质化茎段分别消毒5.5 ～8.0 min，无菌水漂洗3 次。处理后，于无菌条件下接种至1/2 MS 培养基上，于接种后第2 天开始记录污染数。20 d 后统计污染率和成活率（污染率=污染苗数/接种苗数100%，成活率=成活苗数/接种苗数100%）。

1.2.2 腋芽的诱导分化 将消毒处理后的巴戟天茎段分为幼嫩部位、半木质部位、全木质化部位，分别接种于含不同浓度及组合植物生长调节剂的培养基中。培养30 d 后观察结果，记录腋芽诱导率以及腋芽诱导状况，筛选出诱导腋芽的最适部位与最适培养基（腋芽诱导率=产生腋芽的外植体数/接入外植体总数100%）。

1.2.3 丛生芽的增殖培养 将培养30 d，诱导出的腋芽从茎段上切下，接种于不同类型培养基中，接种20 个外植体，培养30 d 后观察结果。记录丛生芽诱导率以及丛生芽生长状况（丛生芽诱导率=产生丛生芽的腋芽数/接入腋芽总数100%）。

1.2.4 组培苗的生根与移栽 （1）生根培養。将培养30 d，诱导出1.5 cm 左右高的丛生芽苗转接到不同类型的生根培养基中，每瓶3～4 个芽苗，共转接4 瓶。在培养室中培养30 d 后，统计其生根率和根系生长状况（生根率=生根的单苗数/接种单苗总数100%）。（2）炼苗与移栽。当组培苗根系长度大于2 cm 后，将完成生根的组培苗连组培瓶移出培养室，保持温度20～25 ℃、相对湿度60%左右，闭盖置于室温自然光条件下放置3 d，然后打开瓶口，自然光下炼苗5 d 或8 d。将炼苗结束的巴戟天组培苗从组培瓶中移出，使用清水洗净根部残留的培养基，将根部浸泡于稀释的多菌灵溶液中5 min，再用流水冲洗4 min。处理后移栽至4 种不同栽培基质的育苗杯中，每1～2 d 喷施1 次水，30 d 后记录移栽存活率（移栽存活率=成活苗数/移栽总苗数100%）。

1.2.5 组培苗与移栽苗的病毒检测 以脱毒组培苗与移栽苗为试验组，田间感病巴戟天为阳性对照组，取各组幼嫩叶片各0.1 g 提取总RNA 后进行反转录，利用设计的3 对特异引物进行RT-PCR检测。反应体系为2×Pfu Master Mix 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，ddH2O 6 μL，cDNA模板2 μL，PCR反应程序为94 ℃ 1 min 30 s，94 ℃20 s，50～60 ℃ 20 s，72 ℃ 60 s，30 个循环，72 ℃5 min 得到最终样品。PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳进行观察。

1.3 数据处理

试验数据采用SPSS 20.0 软件进行单因素方差分析（ANOVA）。

2 结果与分析

2.1 不同消毒处理对茎段消毒效果的影响

不同消毒处理对巴戟天茎段的污染率及成活率均有一定的影响。随氯化汞消毒时间的延长，幼嫩茎段的污染率及成活率成反比，而半木质和全木质茎段的污染率和成活率均逐渐下降（表1）。对于巴戟天幼嫩茎段，消毒8 min 的污染率最低，且成活率在4 组中最高，达到35.12%，因此消毒8 min 为巴戟天幼嫩茎段消毒的优选方法。对于半木质茎段，消毒5.5 min 的成活率最高，接种21个外植体成活10 个，成活率达47.62%，但是污染率偏高，达到47.62%；0.1%氯化汞消毒8 min的污染率最低，只有38.33%，但是成活率也最低，只有30.00%，综合考虑污染率及成活率2 个指标，最终选定0.1%氯化汞溶液消毒6 min 为巴戟天半木质化茎段消毒的优选方法。对于巴戟天的全木质化茎段，消毒8 min 的污染率最低，消毒5.5 min的成活率最高，综合考虑污染率及成活率2 个指标，最终选定0.1%氯化汞溶液消毒6 min 为巴戟天全木质化茎段消毒的优选方法。综上，虽然消毒时间组内之间没有显著差异，但比较3 个部位巴戟天的消毒效果，半木质部位污染率较低，成活率较高，优选其为巴戟天组织培养的外植体部位。

2.2 不同部位茎段对腋芽诱导能力的影响

比较巴戟天不同部位茎段的平均腋芽诱导数及腋芽生长状况，结果如表2 所示。巴戟天的半木质化茎段平均腋芽诱导数大，生长较快，平均腋芽诱导数为1.90 个，一个生长点可见多个腋芽，与幼嫩部位及全木质化部位差异显著（P< 0.05）。幼嫩部位的平均腋芽诱导数低于半木质化部位，高于木质化部位，半木质化部位的平均腋芽诱导数最低，每个生长点仅长一个腋芽。因此最终筛选巴戟天半木质化茎段可作为巴戟天组织培养的理想材料来源。

2.3 不同类型培养基对腋芽诱导能力的影响

比较半木质化巴戟天茎段在3 种不同类型培养基中的腋芽诱导率及其生长状况，结果显示组间并没有明显差异（表3，图1）。以巴戟天半木质化茎段为外植体，接种于含有6-BA 0.2 mg/L的1/2 MS 培养基中，莖段的节点处长出腋芽，腋芽生长状况良好（图1A），巴戟天半木质化茎段诱导腋芽在MS 培养基中生长状况不佳，芽苗瘦弱（图1B），在含有6-BA 0.2 mg/L 的MS 培养基中诱导腋芽出现透明玻璃化现象（图1C）。

2.4 不同类型培养基对丛生芽诱导能力的影响

以1/2 MS 培养基为基础培养基，利用不同浓度配比的6-BA 与NAA 筛选出适合诱导巴戟天茎段丛生芽的培养基。对巴戟天茎段丛生芽在不同类型培养基中生长状况进行统计，结果如表4 和图2 所示。6-BA 0.2 mg/L 的1/2 MS 培养基丛生芽诱导率达到83.33%，丛生芽生长状况良好，叶片呈现深绿色；当6-BA 的浓度升高到0.5 mg/L 时，丛生芽的诱导率反而下降到46.67%，与另外2 组有显著差异性，丛生芽生长缓慢，叶片蜷缩并且出现玻璃化现象；在0.5 mg/L 6-BA 的基础上再添加0.2 mg/L 的NAA，丛生芽的诱导率有所上升，可达73.33%，丛生芽的生长状况有所改善，但是部分丛生芽叶片玻璃化的现象仍然存在。

2.5 不同生根培养基对巴戟天生根的影响

分别以1/2 N6、N6、1/2 MS 为基础培养基，添加不同浓度配比的IBA，筛选出适合巴戟天芽苗生根的培养条件。统计巴戟天芽苗移入不同类型培养基的诱导生根率及生根情况，结果见表5 和图3。巴戟天芽苗在添加0.5 mg/L IBA 的1/2 N6及添加1.0 mg/L IBA 的N6 培养基中，未出现生根现象，且巴戟天芽苗在N6 培养基中生长状况较差，出现叶子掉落，萎黄的情况，说明N6 培养基并不适合巴戟天芽苗生根；而在添加不同浓度IBA 的1/2 MS 培养基中均可生根，但在IBA浓度超过1.0 mg/L 的1/2 MS 培养基中出现气生根现象。

2.6 不同类型基质对组培苗炼苗移栽的影响

待巴戟天芽苗在瓶中长至4～5 cm 后，从组培室移至室外炼苗5 d 或8 d 后移栽至含有不同类型基质的育苗杯，统计移栽苗的存活率（表6）。就炼苗时间而言，经过8 d 炼苗时间的移栽苗存活率明显高于5 d 组。几种基质中，当炼苗5 d 时，草炭土与珍珠岩比例1∶1 的组培苗成活率最高，达到88.90%；当炼苗时间为8 d 时，草炭土比珍珠岩1∶1 和草炭土比蛭石1∶1 这2 种基质的成活率最高，均为93.33%。因此最佳基质为草炭土比珍珠岩1∶1 和草炭土比蛭石1∶1。

2.7 巴戟天组培苗与移栽苗脱毒效果评价

利用RT-PCR 方法检测巴戟天脱毒苗与田间感病巴戟天的病毒情况，结果如图4A 所示，根据黄瓜花叶病毒-巴戟天株（Cucumber mosaic virusisolate M. officinalis How， CMVMO）设计的3 对引物均可对黄瓜花叶病毒-巴戟天株进行检测，第二对引物CMVMO2 的特异性最佳。与阳性对照相比，巴戟天组培苗与移栽苗均未检测出特异性高亮度条带，说明该组织培养体系所诱导的巴戟天脱毒苗可成功脱除CMVMO 病毒（图4B）。

3 讨论

近年来关于巴戟天组织培养技术的报道有很多，且选择的培养方式不尽相同。其中陈煌等[14]以巴戟天茎尖或茎节段为试验材料，成功建立了一套巴戟天优质种苗快速繁育应用的组培技术体系。林美珍等[15]以巴戟天幼胚为外植体诱导愈伤组织，再由愈伤组织分化成完整植株，并诱导出多倍体巴戟天。巴戟天是广东的道地药材，必须要保持巴戟天的品种特性，因此本研究选用直接器官发生途径建立巴戟天组织培养体系，本方法不经过愈伤组织阶段，具有极强的遗传稳定性。

研究表明，利用巴戟天不同部位茎段作外植体，对其消毒效果也会有所不同。使用相同的消毒处理方法，半木質化茎段的污染率较低，成活率相对较高，若巴戟天茎段太幼嫩会对氯化汞不耐受，从而降低成活率，而全木质化茎段污染的主要来源为真菌污染，主要表现为培养基上生长白色的霉菌。巴戟天表面被有绒毛，容易带有真菌及细菌且不易消除，其中以全木质化茎段表面最为粗糙，是其污染率较高的主要原因。另外，选择不同部位茎段作为外植体，其腋芽的发生情况也不相同，茎段不同取材部位诱导腋芽能力由强到弱依次为半木质部位、幼嫩部位、全木质部位。以巴戟天茎段为材料诱导腋芽，数量多，基数大，增殖快，容易诱导成功，能为巴戟天种苗的工厂化生产提供研究基础。该结果与黄宁珍等[16]、陈伟等[17]的结果一致。本研究以巴戟天茎段为材料诱导腋芽，并进一步增殖，其诱导最适培养基为添加6-BA 0.2 mg/L 的1/2 MS 培养基。巴戟天常规的外植体材料包括叶片及茎段等，分化能力较差，丛生芽诱导率较低。本研究以巴戟天半木质化茎段诱导出的腋芽为材料，其分化能力较强，为理想的巴戟天丛生芽诱导来源。以茎段诱导的腋芽为外植体，接种于添加6-BA 0.2 mg/L的1/2 MS 培养基上（与诱导茎段腋芽的培养基相同），丛生芽的诱导率达到86.36%。巴戟天移栽到疏松透气、偏酸性的土壤可提高其移栽成活率，故选用偏酸性的材料作为培养基质[14]。草炭土中富含有机质，质地松软，呈微酸性，但其缺乏保水性。珍珠岩和蛭石在农业育苗中均有改善土壤、增加土壤透气性、保水保湿等作用。但由于二者保水效果好，过度添加反而导致基质中水分过多，使植株死亡。农业上巴戟天种植通常使用红土[18]，但红土黏性较大，透气性差，土质偏重，不能和珍珠岩很好地混合，易导致根系腐烂。因此，在巴戟天组培苗移栽初期，最好选择草炭土与珍珠岩或蛭石混合使用，既保水又有透气性。

研究结果还表明，选用1/2 MS 培养基作为基础培养基，其生根效果要比选用N6 培养基的好，这与肖祖飞等[19]对樟树、张琨等[20]对黄花菜、刘丹等[21]对附子的研究结果一致，且巴戟天芽苗在N6 培养基中生长状况较差，出现叶子掉落，萎黄的情况，推测为N6 培养基中大量元素含量较低导致。此外，本研究还通过RT-PCR 的方法检测巴戟天脱毒苗中黄瓜花叶病毒-巴戟天株（CMVMO），结果发现巴戟天脱毒苗已彻底脱除病毒，近年来，组织培养技术已广泛应用于对中草药脱毒培养[22]。因此，本研究认为通过组织培养技术可以实现巴戟天的脱毒培养与快繁，为巴戟天种苗的脱毒快繁与工厂化生产提供参考。

由于本研究主要针对农家品种巴戟天大叶型巴戟天与小叶黑蕊型巴戟天，使得本研究结果不一定适用于其他品种巴戟天，有一定的局限性。但利用本研究结果，可为农家品种巴戟天的脱毒快繁技术在生产上的运用提供参考，为巴戟天的种质资源保护、脱毒扩繁、品种改良等提供理论依据。

4 结论

本研究以巴戟天茎段为材料，经75%乙醇预处理后的茎段用0.1%氯化汞溶液消毒5.5 min 为巴戟天茎段消毒的优选方法；以巴戟天半木质部位作为外植体接种的腋芽诱导能力最强；巴戟天茎段诱导腋芽的最适培养基为添加0.2 mg/L6-BA 激素的1/2 MS 培养基；巴戟天茎段诱导丛生芽的最适培养基为添加0.2 mg/L 6-BA 激素的1/2 MS 培养基；诱导巴戟天芽苗生根的最佳培养基为添加0.5 mg/L IBA 激素的1/2 MS 培养基；巴戟天组培苗的最适移栽基质为草炭土∶珍珠岩1∶1 和草炭土∶蛭石1∶1 的基质。通过组织培养技术可以实现巴戟天的脱毒培养与快繁。