β-catenin、Biglycan蛋白在结肠癌中的表达及临床意义*

庄义娟 ，张欢，关蕾 ，刘汉忠 ，陈军芳

［1.锦州医科大学研究生培养基地（孝感市中心医院），湖北 孝感 432000；2.武汉科技大学附属孝感医院（孝感市中心医院），湖北 孝感 432000；3.湖北职业技术学院，湖北 孝感 432000］

结肠癌是消化道常见恶性肿瘤，据2020 年全球癌症发病率和死亡率的统计，结肠癌在全球癌症发病率排名第三，死亡率第二。我国结肠癌发病率高居第二，每年新发人数可达55 万，严重危害人类健康，需引起高度警惕［1］。β-链蛋白（β-catenin）是WNT 信号通路中的重要作用因子，β-catenin 阳性表达上升，能够通过激活WNT 信号通路，导致下游癌细胞核转录活性的增强，使癌细胞DNA 的复制速度明显增强［2］。双糖链蛋白聚糖（Biglycan）属于富含亮氨酸的小分子蛋白聚糖家族，是一种细胞外基质蛋白。现有研究发现Biglycan 在多种肿瘤中表达，且与肿瘤的发生、发展相关，更有研究者发现Biglycan 在结肠癌中高表达且与肿瘤不良预后因素相关［3-5］，前有学者研究发现在骨肉瘤中Biglycan 可经Wnt/β-Catenin 信号通路促进瘤细胞的生长［6］。错配修复（mismatch repair,MMR）系统是一系列修复DNA碱基错配的特异性修复蛋白，MMR 系统功能受损或缺失（dMMR），则丧失本身的校验核对功能，导致DNA 错配堆积，微卫星重复序列拷贝数目发生变化，从而产生遗传不稳定性，称为微卫星不稳定性（microsatellite instability,MSI）。MSI 可进一步分为高度微卫星不稳定性（MSI-H）和低度微卫星不稳定性/微卫星稳定性（MSI-L/MSS）。MMR基因中任何一个或几个基因突变均可产生MSI 表型［7］。另有研究发现MSI-H 肿瘤组中出现低或零的β-Catenin 阳性表达，而MSS 或MSI-L 的肿瘤组显示出高含量的β-Catenin 阳性表达，揭示了两组肿瘤表现出的不同临床行为表现［8］。综上，为探寻Biglycan 蛋白与β-catenin 蛋白表达及其与结肠癌的关系，其次探究β-catenin 蛋白是否在MSI-H与MSI-L/MSS 两组肿瘤中存在不同表达，选取80例结肠癌患者作为研究对象，应用免疫组织化学染色方法检测癌组织中β-catenin、Biglycan 蛋白，应用PCR 方法检测分析癌组织中MSI 状态并分组，分析不同组别间β-catenin 阳性表达率。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2019 年1 月至2020 年6 月孝感市中心医院收治的结肠癌患者80 例为研究对象，其中男性43 例，女性37 例；年龄22～86 岁，平均（63.55±12.30）岁。TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期30 例，Ⅲ期50 例；肿瘤部位：右半结肠47 例，左半结肠33 例；分化程度：高、中分化42 例，低分化38 例；浸润程度：T1～T2 期23 例，T3～T4 期57例；淋巴结转移情况：无淋巴结转移（N0）38例，有1～3 枚淋巴结转移或见任一癌结节（N1）23 例，有4～6 枚淋巴结转移（N2）6 例，有大于等于7 枚淋巴结转移（N3）13 例。本研究经本院伦理委员会批准同意。

纳入标准：①经临床及病理组织学确诊为原发性结肠癌；②入组前未行放疗、化疗及手术治疗等；③患者及家属同意并签署知情同意书。排除标准：①合并有其他部位肿瘤；②患有严重精神疾病；③心、肾、肝脏等功能严重不足。

1.2 主要仪器和试剂

光学显微镜（型号：BX53，奥林巴斯工业有限公司）、免疫组织化学染色试剂盒（货号：JY-0015，公司：武汉珈源生物医学）、Idylla 全自动PCR 肿瘤基因检测系统（公司：武汉福达祥康科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 样本制备 收集根治术后结肠癌标本切取癌组织及癌旁组织（距癌组织≥5 cm）经10%中性福尔马林缓冲溶液固定后脱水、浸蜡、包埋、切片等处理后分别制成3～4 μm 厚的石蜡切片用于免疫组织化学染色、5～10 μm 厚的石蜡切片用于PCR肿瘤MSI 检测。

1.3.2 免疫组织化学染色法检测 严格按照免疫组织化学染色试剂盒说明书进行操作，实验最终所得切片在光学显微镜下观察并采集图像。染色结果判定：细胞核中出现棕黄色或棕褐色颗粒为β-catenin 阳性细胞，细胞质或细胞膜中出现棕黄色或棕褐色颗粒为β-catenin 阴性细胞；细胞浆中出现棕黄色或棕褐色颗粒为Biglycan 阳性细胞，按染色强度记录，染色强度：无色、淡黄、棕黄、棕褐色分别记0、1、2、3 分，0～1 为阴性，2～3为阳性。

1.3.3 微卫星不稳定检测 实验所用PCR-MSI 检测分析系统可检测7 个标志物（AVR2A、BTBD7、DIDO1、MRE11、RYR3、SEC31A、SULF2），检测方法过程严格按照分析系统说明要求完成前期标本处理、试剂盒加样并编号上机，最终系统显示每个标志物检测结果：检测到突变的标志物得分为0.50～1.00、未检测到突变的标志物得分为小于0.50 及无效（Invalid），可得到的结果有4 种：MSI-H（≥2 个标志物突变）、MSI-L（＜2 个标志物突变）、MSS（无标志物突变）及Invalid（＞2 个标志物结果无效）。

1.4 统计学方法

应用SPSS 26.0 统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（）表示，比较用t检验；计数资料以百分率（%）表示，比较用χ2检验；采用Pearson 法进行相关性分析；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠组织中β-catenin 蛋白及Biglycan 蛋白的表达

β-catenin 蛋白阴性表达定位在细胞膜和细胞浆，异常阳性表达定位于细胞核，肠癌组织中细胞阳性表达率显著高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。Biglycan 蛋白阳性表达定位在细胞质中表达，结肠癌组织中Biglycan 蛋白阳性表达率显著高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图1。

图1 结肠癌组织中Biglycan 蛋白与β-catenin 蛋白表达

表1 Biglycan 蛋白与β-catenin 蛋白在结肠癌与癌旁组织中的表达

2.2 β-catenin 蛋白和Biglycan 蛋白阳性表达与结肠癌临床病理特征的关系

结肠癌组织中β-catenin 蛋白阳性表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、大体类型无明显相关性（P均＞0.05），与分化程度、浸润深度、脉管侵犯、淋巴结转移及TNM 分期有相关性（P均＜0.05）；Biglycan 蛋白表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、大体类型、分化程度及脉管侵犯无明显相关性（P均＞0.05），与浸润深度、淋巴结转移及TNM 分期有相关性（P均＜0.05），见表2。

表2 β-catenin 蛋白与Biglycan 蛋白表达水平与结肠癌临床病理特征的关系（例）

2.3 β-catenin 和Biglycan 的相关性

Speraman 相关性分析发现，结肠癌组织中β-catenin 与Biglycan 表达具有相关性（r=0.992,P＜0.001），见图2。

图2 结肠癌组织中β-catenin 与Biglycan 的相关性

2.4 β-catenin 在MSI-H 与MSS/MSI-L 两组肿瘤中阳性表达率

在入组的80 例结肠癌患者中，经PCR 方法测定并分类，80 例结肠癌中MSI-H 组有10 例，β-catenin 阳性表达率为40.0%，MSI-L/MSS 组有70 例，β-catenin 阳性表达率为61.4%，两组结肠癌中β-catenin 阳性表达率相比，差异无统计学意义（P=0.345＞0.05）。见表3 及图3。

图3 微卫星不稳定检测结果

表3 结肠癌MSI-H 组与MSS/MSI-L 组中β-catenin 的表达 ［n(%)］

3 讨论

结肠癌是世界三大癌症之一，发病率和死亡率高居前三，每年死于癌症患者有近千万，而死于结直肠癌的患者近10%，结直肠癌的防治研究工作刻不容缓［1］。结肠癌的发生及发展是一个涉及多基因、多阶段的复杂过程。结肠癌患者早期症状不典型，常表现为便秘、大便习惯改变、腹痛、腹泻等症状，多未引起注意，大多患者就诊时已进展至中晚期，影响患者术后生活质量［9］。时代变迁，人们健康意识不断提升和健康宣教的普及，加之内窥镜检查和影像学技术不断更新提升，很多结肠病变得以早发现、早诊断、早治疗，但也为了进一步做好结肠癌的防治工作，造福更多病患，探究有关结肠癌发生发展中影响因素有助于了解疾病转归、探寻预后不良的相关因素，有助于制定并完善个体治疗方案，对改善患者预后有一定意义。

双糖链蛋白聚糖（Biglycan,BGN）属于富含亮氨酸的小蛋白聚糖类家族（SLRPs），参与构成细胞外基，它由两个糖胺多糖和一个核心蛋白组成，核心蛋白分子量为38 kD，含10 个富亮氨酸的重复单位，糖胺多糖由硫酸皮质素/硫酸软骨素组成，BGN 长约8 kb，含有内含子和8 个外显子，位于Xq27-Xq28，最早于骨组织中发现［10］。

BGN 在肿瘤的生物发生和发展中起重要作用，在胃癌、结直肠癌、膀胱癌、子宫内膜癌等多种癌症中均发现异常BGN 表达。有研究证实BGN在结肠癌中高表达，并且与其组织学分级、淋巴结转移及远处器官转移相关［11-13］。BGN 表达失调可导致多种临床疾病的发生，如代谢紊乱、炎症性疾病、肌肉骨骼缺损和恶性肿瘤等，在癌症中，BGN 的高表达促进了肿瘤的生长、侵袭和转移，这与临床预后不良有关［14］。新兴研究表明，BGN参与多种生物事件，包括细胞增殖和分化、血管形成、骨折愈合、组织修复和炎症［15］。在各种类型的实体癌患者中，BGN 的上调与预后不良相关，BGN 在实体瘤中的表达增加及其与预后不良的相关性表明，BGN 可作为多种类型肿瘤的预后指标［16］。

Wnt/β-catenin 信号转导广泛涉及人类癌症和动物实验癌症模型。大量研究表明，WNT 信号通路的激活是结肠癌早期的重要标志，超过90%的结肠癌存在WNT 信号通路的异常激活，NF-κB 信号通路的异常活化是促进结肠癌发生、发展和治疗抵抗的重要因素［17-18］。当细胞的WNT 信号通路信号在无外界刺激时，稳定状态下Axin/GSK-3β/APC复合体可解体β-catenin 蛋白，使其在细胞质中浓度降低且维持在较低水平，当细胞受到外界WNT信号通路信号刺激时，Axin/GSK-3β/APC 复合体构象发生改变进而最终解体，其解体后对β-catenin蛋白解体作用缺失，使得细胞质内的β-catenin 蛋白得以稳定存在且不断积聚，进而转入细胞核内与TCF/LEF 转录因子结合激活信号通路，最终启动下游靶基因的转录［19-20］。有研究认为β-catenin表达上升能够导致结肠癌细胞的侵袭能力的增强，提高了癌细胞对于结肠黏膜基底组织的浸润程度［21］。还有研究者认为β-catenin 的表达上升能够显著促进结肠癌患者的临床预后的恶化［22］。

错配修复系统（mismatch repair,MMR）是机体的一种DNA 基因错配修复机制，主要识别DNA复制过程中的碱基错配，错配修复基因完整（pMMR）可确保DNA 复制过程的准确性，而当错配修复基因缺失（dMMR）时不能修复错配的碱基，出现MSI，一系列调节生长和增值的基因发生突变，致使DNA 遗传不稳定而最终发生肿瘤［23-24］。约15%的结肠癌显示有MSI［25］。病理组织学显示，MSI 的结肠癌多见于近端结肠，癌组织常表现为低分化，癌周伴有淋巴细胞浸润，对化疗的反应与微卫星稳定的结肠癌不同［26］。大约75% 的MSI 结肠癌伴有MLH1 基因高甲基化［27］。MSI 的结肠癌常见遗传改变是致癌的BRAF V600E突变，散发性结肠癌中BRAF V600E 突变与死亡率增加相关［28］。结肠癌中缺乏dMMR/MSI-H 的发生率约占15%，Ⅳ期dMMR/MSI-H 肿瘤仅占所有转移性转移性结肠癌的2%～4%［29-30］。近期研究表明MSI-H 结肠癌患者可从免疫治疗中获益，且预后优于MSS/MSI-L 型结肠癌。有人提出WNT 信号通路的改变可能与MSI 的结肠癌的癌变有关［31］。更有学者指出MSI-H 的结肠癌由于特征性突变导致MMP-3 表达受损，可降低对E-cadhenin 蛋白的水解作用，E-catenin 与β-catenin 连接固定于细胞骨架中，阻止细胞浆中的β-catenin 入核激活WNT信号通路，该研究进一步发现MSI-H 的结肠癌组β-Catenin 阴性表达，而MSS 或MSI-L 的结肠癌组显示出高含量的β-Catenin 阳性表达，提示MSI-H与MSS/MSI-L 的结肠癌具有不同临床表现及预后［8］。

本研究结果显示Biglycan 蛋白表达水平升高与结肠癌的组织学分级、浸润深度、淋巴结转移及TNM 分期有关，提示Biglycan 与蛋白表达水平与结肠癌的组织学分化程度和癌组织的侵袭力相关；β-catenin 蛋白阳性表达率与结肠癌的浸润深度、淋巴结转移及TNM 分期有关，提示β-catenin蛋白表达水平与结肠癌侵袭力及预后相关。与癌旁正常组织相比，Biglycan 表达上调及β-catenin蛋白阳性表达率均明显升高，且相关性分析提示结肠癌组织中Biglycan 表达上调及β-catenin 蛋白阳性表达存在一定相关性，二者在结肠癌的发生、发展中是否存在一定关联性，需待后续进一步实验探究。

此外，笔者对比分析了80 例结肠癌中MSI-H组和MSS/MSI-L 组的β-catenin 蛋白表达情况，本研究入组的80 例结肠癌病例中MSI-H 组有10 例（12.5%），其中β-catenin 蛋白阳性表达率为40.0%，MSS/MSI-L 组有70 例（87.5%），其中β-catenin 蛋白阳性表达率为61.4%，MSI-H 与MSS/MSI-L 两组结肠癌中β-catenin 阳性表达率差异无统计学意义。笔者猜测，一方面可能β-catenin 阳性表达情况确实和微卫星稳定性无明显相关性，另一方面可能研究中入组的MSI-H 组的标本例数太少不足以说明问题，拟进行扩大样本量进一步的确认和分析。

综上所述，结肠癌组织中，Biglycan 蛋白表达上调及β-catenin 蛋白阳性表达均与浸润深度、淋巴结转移及TNM 分期有关，Biglycan 与β-catenin可能作为评估结肠癌患者预后指标。Biglycan 蛋白表达上调及β-catenin 蛋白阳性表达存在一定相关性，识别WNT 信号通路中的关键调控蛋白对结直肠癌的早期诊断还是早期干预治疗均有积极影响，具体Biglycan 与WNT 信号通路激活的是否相关，其相关作用机制尚需后续进一步研究。