不同因素对板栗保藏中氧化的影响

刘书静，魏妍姝，杨如意，曹 蒙，李建芳

（信阳农林学院 食品学院，河南信阳 464000）

板栗是我国食用最早的坚果之一，年产量居世界首位，品种繁多。目前，板栗以鲜果和初加工为主，但是病虫害、内腐病、褐变等问题严重影响了板栗的产量及其深加工产业的发展。研究表明，多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，PPO）是引起板栗褐变的主要因素[1]。多酚氧化酶也称酪氨酸酶，能催化多酚类化合物的氧化反应，形成颜色较深的多酚化合物，导致板栗颜色变暗。在板栗中，多酚氧化酶的活性与褐变有着密切的关系，多酚氧化酶的活性越高，果实的褐变越快，如果减弱或抑制多酚氧化酶的活性，就能延缓果实的褐变速度，影响多酚氧化酶活性的主要因素有温度、pH 值、底物浓度。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花板栗：无病虫害、无机械损伤的新鲜信阳板栗；磷酸缓冲液：天津市恒兴化学试剂制造有限公司；邻苯二酚：上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

XMTD-204 数显恒温水浴锅：上海梅香仪器有限公司；GTR16-2 医用离心机：北京新时代北利医疗器械有限公司；CP214电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；A390 紫外可见分光光度计：翱艺仪器（上海）有限公司；BC/BD-200HEP 电冰柜：青岛海尔特种电冰柜有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 粗酶液的提取

参考饶先军等[2]提取结球生菜中多酚氧化酶的方法，做适当修改。取鲜板栗剥壳去衣，清水清洗后用干净纸巾擦干表面水分，称取5 g 不同部位的板栗，切碎混匀放入研钵中，加入少量石英砂和10 mL pH=7.0 的0.05 mol·L-1的预冷磷酸缓冲液进行冰浴研磨，研磨成匀浆后移到20 管 1.5 mL 离心管中，在4 ℃，12 000 r·min-1条件下冷冻离心15 min，取上清液，在4 ℃冰柜中保存备用。

1.3.2 邻苯二酚溶液的配制

称取0.11 g 的邻苯二酚于烧杯中，加少量纯水，用玻璃棒捣研溶解，用玻璃棒引流进100 mL 棕色容量瓶中，再用纯水冲洗玻璃棒和烧杯3 次，将冲洗后的液体引流进容量瓶中，用纯水定容，摇匀，得到0.01 mol·L-1的邻苯二酚溶液。分别称取0.22 g、0.33 g、0.44 g、0.55 g、0.66 g、0.77 g、0.88 g，0.99 g 和1.10 g 的邻苯二酚，用上述方法配制成0.02 mol·L-1、0.03 mol·L-1、0.04 mol·L-1、0.05 mol·L-1、0.06 mol·L-1、0.07 mol·L-1、0.08 mol·L-1、0.09 mol·L-1和0.10 mol·L-1的邻苯二酚溶液，配制完后贴好标签，放置于阴凉避光处备用。

1.3.3 酶活性测定

取1.5 mL 一定pH 值的磷酸缓冲液和1.0 mL 一定浓度的邻苯二酚溶液于试管中，再加入0.5 mL 酶液，水浴保温3 min 后立即用紫外分光度计测量吸光度并计时，在波长410 nm 下每隔0.5 min 进行吸光度测定，记录以备计算，共记录3 min。以每分钟内吸光度增加0.001 为1 个活性单位U，酶活性可以表示为U·min-1。用在沸水中加热5 min 的酶液为对照，做3 组重复实验，取平均值作为测得的PPO 活性。

1.3.4 温度和底物浓度试验

采用双因素试验[3]，分别在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃条件下让浓度为0.01 mol·L-1、0.02 mol·L-1、0.03 mol·L-1、0.04 mol·L-1、0.05 mol·L-1、0.06 mol·L-1、0.07 mol·L-1、0.08 mol·L-1、0.09 mol·L-1和0.10 mol·L-1的邻苯二酚溶液与PPO 粗酶液反应。取1.5 mL 的pH=7 的磷酸缓冲液和1.0 mL 不同浓度的邻苯二酚溶液于试管中，再加入0.5 mL 酶液，混匀后在不同温度下保温3 min，立即在410 nm 下测定吸光度变化值。

1.3.5 pH 值试验

取1.5 mL 的pH 为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 和9.0的磷酸缓冲液，分别加入1.0 mL 浓度为0.05 mol·L-1的邻苯二酚溶液，加入0.5 mL 酶液后30 ℃保温，迅速倒入比色皿中测吸光度变化值。

1.3.6 褐变指数测定

褐变指数=∑（各褐变级别分值×各级褐变面积百分数）/（褐变最高级别分值×100%），式中各级褐变面积用透明厘米方格纸测定，褐变级别分值按板栗果仁颗粒（直径在1.0 ～2.0 mm）褐变颜色深度评判，具体评分标准见表1。

表1 褐变评分标准

1.3.7 丙二醛含量测定

采用硫代巴比妥酸法测定，从10 个板栗果实中称取样品2.0 g，加入10.0 mL 预冷过的100 g·L-1三氯乙酸溶液研磨成匀浆，将匀浆液4 ℃、12 000 r·min-1离心20 min，收集上清液，低温保存备用。取2.0 mL 上清液，对照管中加2.0 mL 100 g·L-1的三氯乙酸溶液，加入2.0 mL 0.67%的硫代巴比妥酸溶液，混合，煮沸20 min，取出冷却，如有沉淀需再离心，取上清液分别测定反应液在波长450 nm、532 nm、600 nm 的吸光度，重复3 次。根据溶液吸光度计算出反应混合液中丙二醛含量，按公式计算出每克样品中丙二醛含量。

1.4 数据处理

除特殊说明外，所有数据平行测定3 次，用Excel 2010 进行数据处理，计算标准偏差，采用Origin 9 软件处理数据和作图。

2 结果与分析

2.1 不同温度对PPO 活性的影响

如表2 所示，PPO 活性在30 ℃时高，在35 ℃、40 ℃的活性次之，在20 ℃时活性最低。温度对酶活性影响很大，低温有助于抑制PPO 的酶活性，且低温相较于高温对PPO 活性的抑制效果更好。王磊等[4]的研究表明在95 ℃，5 min 左右就会几乎完全抑制PPO 活性。高温虽能更好地抑制酶活性，但是对于板栗的贮运和鲜销是不利的，所以对于板栗的保鲜采用低温冷藏较好。

表2 不同温度和底物浓度对PPO 活性的影响

2.2 底物浓度对PPO 活性的影响

如表2 所示，在不同的温度下，随着底物浓度的升高，PPO 活性呈现出逐渐上升的趋势，本实验PPO的最适反应条件是30 ℃，底物浓度0.10 mol·L-1。30 ℃时，随着底物浓度的升高，PPO 活性增加的速率先增大再减小，说明温度适宜时，在一定范围内，板栗果实中的多酚类物质越多，板栗果实就越容易褐变。

2.3 不同pH 值对PPO 活性的影响

如图1 所示，当pH 值为4 ～6 时，PPO 活性逐渐升高，pH=6 时PPO 活性最高，pH 值为7 ～9 时，酶液处于碱性环境，PPO 活性迅速下降，pH=9 时，PPO 活性几乎全部丧失。碱性环境比酸性环境对PPO活性的影响大，与王磊等[4]、郑龙等[5]的研究结果一致。

图1 pH 值对PPO 活性的影响

2.4 褐变指数对丙二醛含量的影响

由图2 可知，随着褐变指数的增加，板栗中丙二醛的含量总体呈上升趋势，说明板栗在贮藏过程中脂肪的氧化程度升高。当褐变指数在0.2 时，丙二醛含量较低。褐变指数为0.8 时，丙二醛含量较高，为2.38 µmol·L-1。

图2 褐变指数对丙二醛的影响

3 结论

本实验以信阳板栗为原料，研究温度、pH 值、底物浓度对板栗中多酚氧化酶活性和丙二醛含量的影响。实验结果表明温度对酶活性影响很大，低温能更好地抑制多酚氧化酶的活性；碱性环境能更好地抑制多酚氧化酶的活性，pH=9 时效果最佳；当褐变指数为0.2 时，丙二醛含量较低，褐变指数为0.8 时，丙二醛含量较高，为2.38 µmol·L-1。本次研究发现适当控制温度、pH 值、底物浓度，能很好地抑制多酚氧化酶的活性，提高板栗品质。