气相色谱法测定沃柑中2,4-滴的方法改进

2023-07-09李琬婧覃弘毅

食品安全导刊 2023年16期

李琬婧，覃弘毅

（南宁市食品药品检验所，广西南宁 530007）

2021 年柑橘产季全球柑橘产量达到1.585 亿t，我国柑橘产量居世界首位，达4 460 万t，占全球总产量的28%；出口量91.8 万t 仅排名第5，表明我国柑橘主要用于国内消费[1]。沃柑是盛产于广西武鸣的优秀柑橘品种，深受广大消费者的喜爱。2021 年有媒体报道部分沃柑果商未按规定使用农药，浸泡后的沃柑未经存储安全间隔期，直接送往市场销售，引发消费者对沃柑中农药残留的担忧[2]。因此有必要加强对沃柑中的常用农药2,4-二氯苯氧乙酸的检测。2,4-二氯苯氧乙酸，别名2,4-滴，CAS 号94-75-7，是世界上使用最广泛的除草剂品种之一，可作为杀菌保鲜剂，用于柑橘的防腐保鲜；此外，作为一种植物生长调节剂，2,4-滴在果实膨大期或采收前期使用可膨大果实，防治采前裂果、落果，延长贮存期[3]。

目前测定食用农产品中2,4-滴的方法有气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱联用法与液相色谱-质谱联用法。其中，气相色谱-质谱联用法与液相色谱-质谱联用法前处理简便，具有高灵敏度与高特异性，但仪器较为昂贵，仪器普及程度较低；液相色谱法无需进行衍生化实验，但检测灵敏度较低；气相色谱法虽然需要对2,4-滴进行衍生化，但检测灵敏度高，仪器普及度高，在实际检测中应用广泛。综上所述，本试验选择气相色谱法对2,4-滴进行测定。

我国的《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2021）中规定，2,4- 滴和2,4-滴钠盐在柑中的限量均为0.1 mg·kg-1。在规定了2,4-滴限量的品种中，除了个别品种使用《蔬菜中2,4-D 等13 种除草剂多残留的测定液相色谱质谱法》（NY/T 1434—2007）测定，绝大部分品种的测定方法均指定为《粮食和蔬菜中2,4-滴残留量的测定》（GB/T 5009.175—2003）[4]。由于GB/T 5009.175—2003为2003 年生效的标准[5]，发布至今已有20 年，标准较为老旧，其操作较为烦琐，因此需要对气相色谱法进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沃柑试样8 份（购自不同农贸市场）；2,4-滴溶液标准物质（浓度为1 000 μg·mL-1，北京坛墨质检公司）；乙腈（色谱纯，德国默克公司）；正己烷、丙酮（农残级，德国默克公司）；正丁醇、浓硫酸（分析纯，国药试剂公司）；萃取盐包（4 g MgSO4、1 g NaCl、1 g 柠檬酸钠、0.5 g 柠檬酸氢二钠，天津博纳艾杰尔公司）；15 mL 净化管（900 mg MgSO4、150 mg PSA，天津博纳艾杰尔公司）；无水硫酸钠（分析纯，天津光复公司）；氯化钠（分析纯，国药试剂公司）。

1.2 仪器与设备

GC-2010 Plus 气相色谱仪（配ECD 检测器，日本岛津公司）；2-16KL 冷冻离心机（德国Sigma 公司）；JJ500 电子天平（精度0.01 g，常熟双杰公司）；MS 3 digital 涡旋振荡器（德国爱卡公司）；TurboVap氮吹浓缩仪（瑞典Biotage 公司）；瓶口分液器（德国普兰德公司）；100 μL、1 000 μL、10 000 μL 移液枪（德国普兰德公司）；SA320 振荡器（日本雅马拓公司）；0.22 μm 有机滤膜（上海安谱公司）；1 g/6 mL弗罗里夕固相萃取柱（天津博纳艾杰尔公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 试样处理

（1）提取。称取粉碎混匀的沃柑试样10 g（精确至0.01 g）于50 mL 离心管中，加入20 mL 乙腈，振荡提取5 min，加入萃取盐包，加入两颗陶瓷均质子，加盖迅速摇匀，振荡混匀5 min，以6 000 r·min-1离心5 min。精密移取上清液10 mL 于15 mL 离心管中，50 ℃氮吹近干。

（2）衍生化。向上述离心管中加入200 μL 的正丁醇-浓硫酸（4+1）溶液，于室温下反应1 h。加入3 mL正己烷，涡旋1 min 后以6 000 r·min-1离心5 min。将上清液转移至另一15 mL 离心管中，下层用3 mL正己烷重复提取一次，合并两次提取液，50 ℃氮吹浓缩至约1 mL，待净化。

（3）净化。在弗罗里夕固相萃取柱中加入约1 cm厚的无水硫酸钠，先用5 mL 的丙酮-正己烷（1+9）淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液，接着加入上述待净化液，用5 mL 的丙酮-正己烷（1+9）洗脱，收集全部洗脱液于15 mL 离心管中，50 ℃氮吹浓缩近干，加入1 mL 正己烷复溶，涡旋1 min，过0.22 μm 有机滤膜，装瓶待上机测定。

1.3.2 标准溶液配制

准确吸取1 mL 浓度为1 000 μg·mL-1的2,4-滴溶液标准物质于10 mL 容量瓶中，用丙酮稀释并定容，得浓度为100 μg·mL-1的2,4-滴溶液。准确吸取1 mL 浓度为100 μg·mL-1的2,4-滴溶液于10 mL容量瓶中，用丙酮稀释并定容，得浓度为10 μg·mL-1的2,4-滴溶液。分别准确吸取0.01 mL、0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL 和0.50 mL 的2,4- 滴溶液（浓度10 μg·mL-1）于10 mL 容量瓶中，用丙酮稀释并定容。准确吸取1 mL 各浓度的标准溶液于15 mL 离心管中，50 ℃氮吹近干，后按样品的衍生化步骤对标准曲线溶液进行衍生化，氮吹近干后，加入1 mL 正己烷复溶，转移至样品瓶中进行测定。

1.3.3 气相色谱条件

色谱柱：DB-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm，美国安捷伦公司）；进样口温度：260 ℃；进样量：1 μL；不分流进样；载气：高纯氮；载气流速：1 mL·min-1；程序升温：起始温度为80 ℃保持1 min，以10 ℃·min-1的速率升温至230 ℃，以30 ℃·min-1的速率升温至260 ℃保持10 min；检测器温度：300 ℃；尾吹气：60 mL·min-1；载气：1 mL·min-1；采用外标法定量。

2 结果与分析

2.1 提取方法优化

提取溶剂不仅要能高效地提取目标化合物，同时要尽可能少地提取出其他杂质，避免干扰，且不会对实验人员的安全健康造成较大伤害。目前提取2,4-滴的溶剂主要有乙醚[5]、丙酮[6]、二氯甲烷[7]、乙腈[8]、乙酸乙酯[9]、氢氧化钠溶液[10]及丙酮+正己烷[11]等。其中乙醚、二氯甲烷毒性较大，不利于实验人员的健康；乙酸乙酯提取使用量大，不仅浪费试剂，后续操作无论是旋蒸浓缩还是直接过柱都要耗费大量时间；氢氧化钠溶液则不利于后续衍生化操作；丙酮、丙酮+正己烷的提取操作较为烦琐。有研究考察了纯乙腈、1%甲酸乙腈、2%甲酸乙腈3 种提取溶剂的提取情况，回收率都在满意范围；且由于柑橘本身的低pH 值属性，加酸对萃取溶液的pH 值改变不大[8]。综上所述，本试验采用乙腈作为提取溶剂。

QuEChERS 是常用的农药兽药残留前处理方式，我国近年来也发布了较多采用QuEChERS 作为前处理方法的国家标准，如GB 23200.113—2018、GB 23200.121—2021 等。本试验考察了萃取盐包、萃取盐包+净化管、NaCl（5 g）3 种盐析分层净化的方式，其中萃取盐包与NaCl 的回收率优秀，而萃取盐包+净化管的回收率较差，无法满足准确度要求。同时，有文献表明PSA 对2,4-滴有强烈的吸附[8]。使用NaCl 在单个实验时可以接受，但在批量实验时，称量NaCl 花费的时间较多，极大地影响工作效率；而萃取盐包均有成品售卖，可以直接购买使用。因此本试验从提高工作效率的角度出发，不考虑NaCl作为盐析试剂。为了避免PSA 对2,4-滴的吸附，本试验仅使用萃取盐包对提取液进行盐析分层，且后续有固相萃取作为净化步骤，因此省略净化管的操作对净化效果影响不大。

2.2 衍生化方法优化

查阅相关标准与研究文献可知，常见的衍生化试剂有14%三氟化硼丁醇溶液（5 mL）[5]、三氟化硼甲醇溶液（5 mL）[11]、正丁醇+浓硫酸（4+1，200 μL）[6]。另有研究考察了无水乙醇、异丙醇、正丁醇、正戊醇、异戊醇作为衍生化试剂的效果，其中异戊醇衍生化结果的灵敏度最好，正丁醇其次[12]。综合考虑，本试验对比了14%三氟化硼丁醇溶液（5 mL）与正丁醇+浓硫酸（4+1，200 μL）的衍生化效果，结果表明这两种衍生化试剂的衍生效率没有明显差异。但三氟化硼丁醇溶液价格比较昂贵，每次衍生化用量很大，试验成本较高；相比之下正丁醇与浓硫酸均为实验室的常规试剂，价格低廉，每次用量仅为三氟化硼丁醇溶液的1/25。因此本试验选择正丁醇+浓硫酸（4+1，200 μL）作为衍生化试剂，降低成本的同时兼顾了衍生效率。

2.3 方法学评价

2.3.1 线性范围与检出限、定量限

根据1.3.2 配制了0.010 mg·L-1、0.020 mg·L-1、0.050 mg·L-1、0.100 mg·L-1、0.200 mg·L-1和0.500 mg·L-1的2,4-滴标准工作曲线。测定结果表明，2,4-滴在0.010 ～0.500 mg·L-1线性关系良好，相关系数为0.999，回归方程为y=1 042.11x+9 998.80。根据GB 2763—2021 对沃柑中2,4-滴的限量要求，采用添加法确定检出限和定量限。根据信噪比（S/N）=3确定检出限，本方法的检出限为0.000 3 mg·kg-1；信噪比（S/N）=10 确定定量限，本方法的定量限为0.001 mg·kg-1。

2.3.2 准确度与精密度

用空白的沃柑样品分别进行0.010 mg·kg-1、0.050 mg·kg-1、0.100 mg·kg-1共3 个水平的加标回收试验，每个水平重复3 次。表1 结果表明，回收率为82.7%～90.7%，相对标准偏差（RSD）为1.6%～4.7%，其准确度与精密度均符合GB/T 27417—2017[13]的要求。