小麦株高相关基因TaGAMyb-B在水稻中的功能研究

刘 娟,冯玉梅,韩 冰 ,邢燕平,李淑芬,杨 燕

(1.内蒙古农业大学 生命科学学院 植物生物技术功能实验室,内蒙古 呼和浩特 010010;2.内蒙古自治区农牧业科学院,内蒙古 呼和浩特 010031)

小麦(TriticumaestivumL.)属于禾本科(Poaceae)小麦族(Triticeae dumort)小麦属(TriticumL.)。作为世界三大粮食作物之一,全球有近35%的人口以小麦为主食,据预测,到2050年,全世界人口将达到97亿,人类对小麦的需求将会持续不断地增加[1-2],随着农业生产的快速发展,农作物的产量虽有了显著提高,但由于生产条件改变所引起的倒伏问题也频繁发生,因此,培育抗倒伏品种成为作物高产育种的主要目标之一。在小麦育种工作中,小麦品种、环境因素和栽培措施都会使小麦发生倒伏现象,小麦自身品种因素作为主要因素,主要包括株高、节间长度、茎壁厚度、节间重量以及节间中纤维素和木质素含量等[3]。株高的建成直接影响到小麦的抗倒伏性,研究发现,小麦株高与倒伏呈显著正相关,在没有倒伏的前提下,小麦株高与产量呈正相关[4-5]。株高的降低增加了植株的抗倒伏性,并使更多的营养物质转移到发育的籽粒中[6]。目前,通过控制株高来优化小麦株型,增强其倒伏性已经成为小麦高产育种的重点工作。

小麦株高属于微效多基因控制的复杂数量性状,在其建成过程中会受Rht-1、Rht-2、Rht8、GAMyb、GA20ox和GA3ox等遗传因素[7-8]以及环境因素的影响[9]。GAMyb基因是从大麦糊粉层细胞的cDNA文库中分离发现[10],属于GAs诱导的R2R3型MYB类转录因子[11],在GA信号转导途径中起正向调控作用[12],具有促进种子萌发、花粉萌发及茎秆伸长等功能[13-15]。在小麦中,TaGAMyb基因定位于3AL3-0.42-0.78、3BL3-0.63-1.00和3DL3-0.81-1.00染色体上,Haseneyer等[16]在42份小麦的A、B和D染色体上分别鉴定出1,7,3种单倍型,由此可以看出,不同基因型小麦材料中TaGAMyb-A是完全保守的,而TaGAMyb-B和TaGAMyb-D存在多个等位变异,TaGAMyb-B的等位变异更加丰富。刘进英等[17]在不同休眠特性的小麦材料中克隆了TaGAMyb基因在3A、3B和3D染色体上的全长,发现TaGAMyb-B基因在小麦中存在2种等位基因,将其分别命名为TaGAMyb-Ba(GenBank:KU589288)和TaGAMyb-Bb(GenBank:KU589289),与TaGAMyb-Ba序列相比,TaGAMyb-Bb在第一内含子存在84 bp的插入序列。刘梦等[18]利用93份春小麦自然群体研究发现,TaGAMyb-Ba和TaGAMyb-Bb2种等位基因型材料与春小麦株高显著相关。本研究将利用农杆菌介导转化技术进一步明确小麦TaGAMyb-B第一内含子区的84 bp差异序列在水稻中的功能。

1 材料和方法

1.1 试验材料

水稻遗传转化受体:粳稻日本晴。

1.2 试验引物

根据内蒙古农业大学生命科学学院植物生物技术功能实验室在GenBank中注册的TaGAMyb-Ba和TaGAMyb-Bb的序列,设计特异性引物扩增TaGAMyb-Ba和TaGAMyb-Bb(第一内含子存在84 bp的插入序列)的基因组序列。所用引物均由北京六合华大基因科技有限公司合成(www.bgi-write.com),序列信息见表1。

1.3 试验方法

1.3.1 水稻转基因植株的获得 将构建好的植物融合表达载体(pCAMBIA1390-Ubi-TaGAMyb-Ba/b-GFP)和空载体(pCAMBIA1390-Ubi-GFP)经酶切和PCR双重鉴定正确后转化农杆菌EHA105感受态细胞,利用农杆菌侵染技术侵染日本晴种子的愈伤组织,经筛选、继代培养、鉴定获得阳性再生苗[19],继续培育,获得T1种子。上述转基因水稻材料种植于安徽省农业科学院岗集基地。

随机选取T1各转基因型水稻和对照组共21个株系,每个株系随机选取8～10粒种子进行萌发,培育到三叶期时,剪取每个株系的单株幼嫩叶片,提取基因组DNA,PCR鉴定阳性株系。接着,分别选取各转基因型水稻T1阳性株系进行小苗的培育(28 ℃,白天光照16 h/晚上光照8 h),待长至三叶期时,剪取幼苗叶片再进行阳性单株的鉴定,将阳性单株移栽继续进行水培,每个株系至少20个单株,培养获得T2种子。上述转基因水稻材料种植于河南省濮阳市试验田。

酶切反应体系为:质粒DNA 7 μL,内切酶KpnⅠ和PmlⅠ/BamHⅠ各1 μL,10×K Buffer 1 μL,BSA 2 μL,加RNase Free ddH2O至20 μL。

PCR反应体系为:模板DNA 1 μL,2× EasyTaq PCR SuperMix 6.2 μL,引物0.15 μL(浓度:0.025 nmol/μL),加灭菌双蒸水至15 μL。PCR反应程序为:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,退火温度见表1,时间为30 s,72 ℃延伸30 s,35个循环;72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测,Gold View核酸染料染色,缓冲体系为1×TAE溶液,100 V电压下电泳15 min,在凝胶成像仪下观察并照相。

1.3.2 转基因后代的鉴定与分析

1.3.2.1 T1转基因植株的PCR鉴定 以相同转化条件下转化空载体的转基因材料作为对照组,以排除报告基因或其他非目标基因的表达对目标基因转录及植株表型的影响[20]。剪取转基因水稻的幼嫩叶片,用新型植物基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA,用表达载体特异性引物对JDF/R(该引物横跨载体和目的基因设计)部分目的基因和部分载体序列进行PCR扩增,以检测转基因后代中的PCR阳性株系。

1.3.2.2 转录本表达分析 提取转基因水稻总RNA并反转录为cDNA。以水稻Q-OsActinF/R作为内参,并以转基因水稻种子、根、茎以及叶的cDNA(稀释20倍)为模板,每个样品进行3次技术重复,3次生物学重复。分析结果采用2-ΔΔCt计算[21]。具体步骤见Feng等[22]的方法。

1.3.3 胁迫处理 选取饱满的T2转基因水稻种子,经无水乙醇浸泡消毒后,进行幼苗培育(28 ℃,白天光照16 h/晚上光照8 h),待生长至14 d,采用浇灌的方式分别进行以下胁迫处理。激素胁迫:在培养皿中加入100 mL 0.2 mg/L的GA3;盐胁迫:在培养皿中加入100 mL 150 mmol/L的NaCl;干旱胁迫:在培养皿中加入100 mL 300 mmol/L的甘露醇。分别于处理前(0 h)和处理后2,6,12,24,48 h取样、液氮速冻,-80 ℃保存备用,每个试验重复3次。

1.3.4 T2转基因水稻表型鉴定 收获T2转TaGAMyb-Ba-GFP和TaGAMyb-Bb-GFP基因型水稻,每株系选取10棵单株进行株高,穗长,第一、二、三茎长及茎粗,百粒质量,穗粒质量和分蘖等表型鉴定和分析。

1.3.5 转基因水稻第二节间石蜡切片制作与分析 分别选取转TaGAMyb-Ba-GFP和TaGAMyb-Bb-GFP基因型水稻的T2成熟种子进行培养(28 ℃,白天光照16 h/晚上光照8 h)。待幼苗发芽并生长至14 d剪取单株第二茎节,用于制作转基因水稻第二节间石蜡切片,制作方法参照毛晓霞[23]的方法。

2 结果与分析

2.1 重组载体的鉴定

将构建好的重组载体TaGAMyb-Ba-GFP和TaGAMyb-Bb-GFP经过酶切鉴定(图1)与PCR鉴定均得到预期大小的目的片段(图2),同时测序结果也进一步表明表达载体TaGAMyb-Ba-GFP和TaGAMyb-Bb-GFP构建成功。

M.DL10000 bp DNA Marker;1.Ubi-TaGAMyb-Bb-GFP;2.Ubi-TaGAMyb-Ba-GFP.

M.DL1000 bp DNA Marker;1.TaGAMyb-Bb(764 bp);2.TaGAMyb-Ba(659 bp).

M.DL2000 bp DNA Marker;1—9.部分转基因水稻阳性单株;CK.转基因水稻阴性单株(没有该检测基因)。 M.DL2000 bp DNA Marker;1—9.Some positive individuals of transgenic rice; CK.Negative individuals of transgenic rice(no gene for this test).

2.2 转基因水稻的鉴定

2.2.1 转基因水稻T1的PCR鉴定 用特异性引物JDF/R对转基因水稻T1各株系单株进行PCR阳性检测(图 3),在检测的20个转TaGAMyb-Ba-GFP和TaGAMyb-Bb-GFP基因型水稻株系中,共检测到19个阳性单株,转基因效率为95%。

2.2.2 转基因水稻不同组织器官中TaGAMyb-B转录本的表达分析 对转TaGAMyb-Ba-GFP和TaGAMyb-Bb-GFP基因型水稻株系T2种子以及生长30 d幼苗的根、茎、叶进行RT-qPCR分析,结果表明,在转TaGAMyb-Ba-GFP和TaGAMyb-Bb-GFP基因型水稻被检测的各组织中,TaGAMyb-B的转录本均有表达,且在各组织中转录本表达水平的趋势为茎>根>种子>叶(图4)。

图4 转基因水稻中TaGAMyb-B基因的相对表达量Fig.4 The relative expression levels of TaGAMyb-B in transgenic rice

2.2.3 转基因水稻在不同胁迫处理下TaGAMyb-B转录本表达变化 小麦株高由多个节间构成,基部节间的健壮程度与小麦抗倒伏性相关程度为:第二节间>第一节间>第三节间[24]。为进一步研究转基因水稻在应对不同非生物胁迫处理时TaGAMyb-B基因转录本的表达变化,对转TaGAMyb-Ba-GFP和TaGAMyb-Bb-GFP基因型水稻T2的第二茎节分别用NaCl(150 mmol/L)、甘露醇(300 mmol/L)和GA(0.2 mg/L)处理2,6,12,24,48 h,以处理前0 h作为对照。RT-qPCR分析结果显示(图5):在NaCl(150 mmol/L)胁迫处理不同时间的第二茎节材料TaGAMyb-B在各处理时期的表达量总是TaGAMyb-Bb-GFP大于TaGAMyb-Ba-GFP;并且转录本表达量的变化趋势在处理6 h之前,转TaGAMyb-Ba-GFP材料几乎没有变化,而转TaGAMyb-Bb-GFP基因型材料TaGAMyb-B转录本的表达量降到了最低值;从NaCl处理6 h之后,TaGAMyb-B转录本的表达量在2种转基因类型材料中均是先升高后降低的趋势,且在处理24 h时再次达到峰值。

图5 不同胁迫处理下转基因水稻中TaGAMyb-B基因的表达变化Fig.5 Expression changes of TaGAMyb-B in transgenic rice with during different stress treatments

在甘露醇(300 mmol/L)胁迫处理不同时间的第二茎节材料,TaGAMyb-B在各处理时期的表达量总是TaGAMyb-Bb-GFP大于TaGAMyb-Ba-GFP。而且转录本表达量的变化趋势均为先迅速升高后缓慢降低,并且在2种转基因材料中,均是在处理2 h时TaGAMyb-B转录本的表达量达到峰值,其中在干旱处理2,6 h时,TaGAMyb-B转录本的表达量是对照组的1.32～2.40倍。

在GA(0.2 mg/L)胁迫处理不同时间的第二茎节材料,TaGAMyb-B在各处理时期的表达量总是TaGAMyb-Bb-GFP大于TaGAMyb-Ba-GFP。TaGAMyb-B在2种转基因材料TaGAMyb-Ba-GFP和TaGAMyb-Bb-GFP中的表达量先逐渐升高后又迅速降低;在GA处理12 h,TaGAMyb-B的表达量分别是对照的9.34,17.61倍;在处理2～12 h过程中,第二茎节中TaGAMyb-B的表达量为TaGAMyb-Bb-GFP大于TaGAMyb-Ba-GFP;处理24～48 h的过程中,第二茎节中TaGAMyb-B的表达量为TaGAMyb-Ba-GFP大于TaGAMyb-Bb-GFP。

以上非生物胁迫处理的试验结果表明,转基因水稻中TaGAMyb-B表达量会受到NaCl、甘露醇及GA诱导胁迫的影响;TaGAMyb-B在各处理各时期的表达量总是TaGAMyb-Bb-GFP大于TaGAMyb-Ba-GFP;且相较于转TaGAMyb-Ba-GFP基因型水稻,转TaGAMyb-Bb-GFP基因型水稻在应对外界非生物胁迫处理时TaGAMyb-B转录本的表达量波动范围更大。

2.2.4 转基因水稻T2表型观察 对T2各转TaGAMyb-Ba-GFP和TaGAMyb-Bb-GFP基因型水稻成熟期表型进行观察统计表明,转TaGAMyb-Ba-GFP、TaGAMyb-Bb-GFP和转空载体对照基因型的表型统计分析如下:平均分蘖数分别为8.27,6.33和4.10(TaGAMyb-Ba-GFP和TaGAMyb-Bb-GFP与对照相比差异显著,P=0.00和P=0.006),且转TaGAMyb-Ba-GFP和TaGAMyb-Bb-GFP基因型水稻二者之间的分蘖数也呈显著差异(P=0.015);穗长分别为16.42,14.40,15.40 cm,且转TaGAMyb-Ba-GFP和TaGAMyb-Bb-GFP基因型水稻间的穗长呈显著差异(P=0.007);第一茎粗分别为3.48,2.97,3.18 mm,第二茎粗分别为3.04,2.50,3.00 mm,第三茎粗分别为2.53,2.14,2.44 mm,且转TaGAMyb-Ba-GFP和TaGAMyb-Bb-GFP基因型水稻二者之间的第一茎粗、第二茎粗、第三茎粗均呈显著差异(P=0.003,P=0.00和P=0.00);第一茎节长分别为1.70,2.00,1.63 cm,第二茎节长为5.97,6.43,5.60 cm,第三茎长为10.90,11.89,10.30 cm(图6)。以上结果表明,转TaGAMyb-Ba-GFP和TaGAMyb-Bb-GFP基因显著影响了转基因水稻的茎粗、分蘖数和穗长。

不同小写字母表示差异显著,P<0.05。图8同。Different lowercase letters indicate significant different,P<0.05.The same as Fig.8.

图7 转基因水稻第二节间横切面Fig.7 Transverse sections of second stem section in transgenic rice

2.2.5 转基因水稻T2第二茎节厚壁细胞观察 马跃芳等[25]研究发现,水稻抗倒伏品种具有矮而强度大的茎秆以及短而结实的第二节间,水稻的茎秆由节间组成,节间由表皮、厚壁组织、维管束以及薄壁组织等组成,其中,厚壁组织对茎支持起关键作用。本研究通过T2表型鉴定发现:转TaGAMyb-Ba-GFP和TaGAMyb-Bb-GFP基因型水稻的茎长和茎粗存在显著差异。进一步对2种转基因材料茎节制作了组织切片,通过对切片的观察和测量发现:转TaGAMyb-Ba-GFP和TaGAMyb-Bb-GFP基因型水稻横切面厚壁组织平均厚度分别为10.26,6.89 μm(图 7),二者呈显著差异(P=0.025)(图8);统计转基因水稻茎节纵切面连续分布的30个完整厚壁细胞的长度,结果显示,转TaGAMyb-Ba-GFP和TaGAMyb-Bb-GFP基因型水稻的厚壁细胞的平均长度分别为23.1 ,40.6 μm(图9),二者呈极显著差异(P=0.00)(图10)。以上研究结果进一步说明,TaGAMyb-B中84 bp的差异显著影响了厚壁组织细胞的宽度和厚壁细胞的长度,进而影响了水稻的茎粗和茎长。

图8 转基因水稻第二节间横切面厚壁组织平均厚度Fig.8 Average thickness of sclerenchyma in transverse sections of second stem section in transgenic rice

图9 转基因水稻第二节间纵切面Fig.9 Longitudinal sections of second stem section in transgenic rice

不同大写字母表示差异极显著,P<0.01。Different capital letters indicate extremely significant,P<0.01.

3 结论与讨论

越来越多的研究发现,内含子中存在调节基因表达的增强元件,对基因的表达具有正向调控作用[26],根据本实验室发现的TaGAMyb-Bb在第一内含子存在一个反向重复的84 bp插入序列,经Blast对比后发现,该重复序列与小麦中国春一个脚手架基因(GenBank:HG670306.1)具有100%的同源性[17]。刘梦等[18]在对TaGAMyb的研究中发现,TaGAMyb-Ba等位基因型材料株高显著高于TaGAMyb-Bb等位基因型材料,同样在转TaGAMyb-Ba-GFP和TaGAMyb-Bb-GFP基因型水稻的T2表型鉴定中发现,平均株高为TaGAMyb-Ba-GFP大于TaGAMyb-Bb-GFP。进一步分析发现,转基因水稻的第一、第二和第三茎节平均长度均为TaGAMyb-Ba-GFP小于TaGAMyb-Bb-GFP,第一、二、三茎节粗度均为TaGAMyb-Ba-GFP大于TaGAMyb-Bb-GFP(P=0.00),并且进一步利用细胞组织学观察验证了以上结果。证明84 bp的序列缺失形成的等位基因TaGAMyb-Ba类型材料不仅增高了水稻植株的高度,而且增加了茎秆的粗度。这一结果和前人研究的关于GAMYB基因具有促进茎秆伸长的功能[13-15]这一结果是相符的,不同之处在于本研究是TaGAMyb-B第一含子中84 bp序列的缺失导致水稻茎秆的伸长和增粗,这一结果将对增加小麦生物产量、籽粒产量并且增加其茎秆的抗倒伏性具有非常重要的意义。

干旱、高盐、激素处理等非生物胁迫都是影响植物生长发育和产量的重要因素。因此,研究应答非生物胁迫的基因和培育抗逆性新品种,对于提高作物产量具有重要的意义。研究发现,转录因子在植物对非生物胁迫的应答中起着重要的作用,而MYB转录因子作为植物最大的转录因子家族之一,在植物的生长发育、代谢、生物和非生物胁迫应答中起着重要的调控作用[24,27]。本研究发现,TaGAMyb-B广泛表达于转基因水稻不同的组织器官中,并且转基因水稻第二节间中TaGAMyb-Bb表达量最高,同时其受到NaCl、甘露醇和GA等各种胁迫处理的影响,在各种胁迫处理下均为TaGAMyb-Bb-GFP大于TaGAMyb-Ba-GFP,同时在各种非生物胁迫处理试验中,TaGAMyb-B的转录本表达变化趋势表现不同。以上结果表明,TaGAMyb-B基因84 bp的序列差异引起该基因的转录本表达量的变化,也引起了应对不同非生物胁迫应答时调控能力的改变。