大鼠高血压病理模型的制备及意义

侯燕琳 刘亚琪 徐源慧 张 鹏 王 凯

（齐鲁医药学院，山东 淄博 255000）

高血压（hypertension，HTN）是指以体循环动脉循环血压（收缩压或舒张压）增高为主要特征，伴有器官功能或器质性损害的临床综合征[1]。《中国心血管健康与疾病报告2020》显示，我国心血管疾病的患病率不断增加，目前我国的心血管病患者数量已达3.3 亿，其中就有2.45 亿名高血压患者。疾病不仅会对身体带来损害，还会造成社会及家庭的经济压力。有关调查研究表明，与城市地区相比，农村地区家庭面临较高的高血压疾病经济负担，因高血压治疗后，贫困人口的比率将上升13.3%，在城镇中，高血压治疗将会使贫困家庭占比提高28.8%，在农村地区，将会提高34.1%[2]。由此看来，控制高血压及其相关疾病的发生具有重要意义。另外，有资料指出高血压可以导致心、脑、肾、血管等的病理性变化，并伴有全身代谢改变，而当血压降低至正常水平或血压越接近正常水平时，越可以逆转此种病理性变化[3]，它主要以体循环动脉血压[收缩压和（或）舒张压]增高等为主要临床表现，还可能导致脑血管病等相关并发症的发生，严重影响人们的身心健康。N-硝基-L精氨酸甲酯（L-NAME）是一氧化氮合酶（NOS）的非选择性抑制剂，具有一定的抗NOS 作用，并可显著地抑制NOS 的活力，从而降低NOS 的产生和合成。它对血管有多重作用，使得乙酰胆碱引起的舒张作用受到抑制，使血管张力增加，并引起动脉血压的增高，进而导致高血压的形成[4-9]。大鼠作为广泛应用的模型动物之一，在生理、遗传、解剖角度上与人类较为相似[10]，且具备生存时间长、发育机能完善、抵抗力好、成本低、生命周期短、易于处理等优点。因此，在本次研究中，我们选用大鼠作为模型制备的对象[11]，并采取L-NAME 与饮用水按比例混合的方法，以自由饮水的方式，使大鼠口服此种按照固定比例配置的药物，从而诱导大鼠高血压模型的建立，最后通过切片（石蜡切片法）病理检查技术、大鼠无创尾动脉测压仪充分观察大鼠器官有无病理性变化、病理改变的具体表现，以及大鼠血压的变化情况。本实验起止时间为2021 年10 月至2022 年1 月，报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验对象 10 周龄左右SD 大鼠，雄性，300±20 g，身长18 cm 左右，济南金丰实验动物有限公司提供。动物许可证号：SYXK（鲁）2019-0019。室温18-24℃，相对湿度40%-70%，自然光照，新鲜干燥饲料足量，环境相对安静，每小时通气次数为8-12次，自由饮水进食。

1.1.2 实验药品 N-硝基-L 精氨酸甲酯（L-NAME）：药品由上海谱振生物科技有限公司提供。单位：1 g。

1.1.3 实验材料 4%中性甲醛溶液（北京兰杰柯科技有限公司）；盖玻片、载玻片（盐城市锦铭实验器材有限公司）。

1.1.4 实验设备 脱水机、切片机（济南丰奥有限公司）；烤片机、漂片仪（常州市郝思琳医用器械有限公司）；组织包埋机；鼠尾动脉测压仪。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 将所有成年雄性SD 大鼠适应性饲养1 周后，按照随机分配的原则分为对照组、造模组：共12 只，每组6 只。

1.2.2 实验步骤 将所有成年SD 雄性大鼠分为两组，每组6 只，正常对照组给予等量正常饮用水，造模组饮水按照L-NAME 与饮用水0.01 g/100 mL的比例充分混匀（L-NAME 为0.01 g，饮用水为100 mL），除饮用水外，其余条件（室温、湿度、光照、饲料等）均保持一致。给药时间为每日1 次，连续5 周[12-13]。末次处理后，采用颈椎脱臼的方法处死大鼠，取全部离体肾脏、脾脏，保存于4%的中性甲醛固定液中，供制备病理切片使用。

1.2.3 大鼠尾动脉血压测定 自造模组大鼠饮用含有L-NAME 的饮用水起，使用大鼠无创尾动脉测压仪进行血压测量，固定每周周末进行1 次血压测量，每次每只大鼠至少测量3 次血压，后取所测收缩压的平均值。测量时应在大鼠尾部局部加热后，大鼠处于相对安静的状态下进行血压测量，并采用秩和检验的方法进行统计学分析。

若结果与正常对照组大鼠相比，造模组大鼠血压明显升高，具有统计学意义（P<0.05），则证明已成功创建L-NAME 诱导的大鼠高血压模型。

1.2.4 病理标准 以切片病理检查为诊断金标准，观察有无玻璃样改变及其改变情况。将离体肾脏、脾脏全部取出，置于固定液中，1 h 后进行取材，通常厚度为0.2-0.3 cm，大小以1.5 cm×1.5 cm 为宜。通过组织石蜡切块技术制备病理切片，以是否出现玻璃样变的结果作为判断单纯口服L-NAME 是否能够成功创建大鼠高血压模型的诊断金标准。若大鼠肾脾脏器中细动脉的管壁增厚、变硬，管腔狭窄，出现均质、红染、半透明和无结构的玻璃样物质，即见明显玻璃样改变[14-15]，由此则说明已成功诱导大鼠高血压模型的建立。

1.2.5 肾、脾脏器组织形态学观察 5 周给药结束后，解剖取两组大鼠肾、脾脏器，置于4%中性甲醛溶液中固定。通过HE 染色等操作，并用中性树胶封固切片后，放于显微镜下观察结构[16-17]。

2 结 果

本实验通过统一设立对照组及造模组，严格控制实验变量，密切记录大鼠血压变化，以病理切片为诊断金标准。通过HE 染色表明，正常对照组大鼠肾、脾脏器官均正常，无病理变化，见图1、图2。而造模组大鼠肾脾脏器中可见明显玻璃样改变，即细动脉的管壁增厚、变硬，管腔狭窄，脆性增加，见图3、图4。另外，与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠血压升高明显，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1、图5。

表1 L-NAME 对大鼠收缩压反应的影响（±s，mmHg）

表1 L-NAME 对大鼠收缩压反应的影响（±s，mmHg）

注：差异有统计学意义（P<0.05）

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图1 正常脾脏动脉血管（×100）

图2 正常肾脏动脉血管（×100）

图3 脾脏动脉血管病变（×100）

图4 肾脏动脉血管病变（×100）

图5 两组每周末平均收缩压情况

本实验表明，通过单纯口服4-5 周的L-NAME即可成功创建大鼠高血压模型。见图3、图4 所示，脾脏发生明显玻璃样改变。

3 讨 论

《中国高血压防治指南（2022 修订版-第三版）》显示，近50 年来我国的高血压患病率呈逐年递增趋势，18 岁以上成人高血压患病率为18.8%，据估算目前大约有2 亿的高血压患者，约占世界患病总人数的1/5，有效控制高血压疾病的发生发展，具有重要现实意义。因此，制备快捷、合适、高效的高血压动物模型对探究高血压疾病具有重大价值，对研究高血压及其相关疾病也发挥着重要作用。

本实验通过L-NAME 对一氧化氮合酶的抑制作用的机理，减少内源性一氧化氮的产生，增加血管的张力，由此建立稳定的动物高血压模型。研究提示，口服含有L-NAME 的饮用水连续5 周后，通过切片病理检查，造模组大鼠肝脏中细动脉管壁增厚，管腔狭窄，出现均匀、红染、半透明和非结构的玻璃状物质，证明已出现明显的玻璃样变，而对照组大鼠肝脏、肾脏均无病理改变，造模成功。因此，通过口服含L-NAME 的饮用水（0.01 g/100 mL）连续5 周即可成功诱导大鼠高血压模型的建立。

目前，在大多数现有的高血压动物模型的制备中，虽制备机制较为单一，但都能在一定程度上反映其临床症状。经大量文献检索发现，目前广泛应用的造模方法有以下几种：例如，苏洁等给予高糖高脂饲料以制备代谢性高血压病模型大鼠[18]；汪雪睿等利用高盐食物诱导大鼠高血压模型[19]；吕行直等利用双肾双夹手术法建立肾性高血压大鼠模型[20]；Hejazi利用点击方法成功制备应激性高血压大鼠模型[21]；以及最广泛应用，与人类原发性高血压高度相似且已经广泛得到国际认可的动物模型之一——自发性高血压大鼠（SHR）的创建等[22]。

本研究采取单纯的口服L-NAME 的方法制备大鼠高血压模型，此法方便快捷、耗时短、成本低、剂量易把握，且无创，造模方法对后续实验操作影响小，并通过HE 染色见大鼠脏器明显玻璃样改变。

但任何研究难免有不足之处，比如，在本次实验中大鼠血压测量主要选取大鼠收缩压为主，而如邓江等则详细记录了大鼠的收缩压、舒张压以及完成测压过程所需要的时间[23]；或由于造模时间较短，肾脏病理改变不够明显，虽然学者Ozen,Ozsoy 等[24-25]通过使大鼠口服L-NAME 连续5 周的方法成功制备了大鼠高血压模型，但由于药物具有的刺激性，有可能导致大鼠饮水量减少，或者存在不同个体饮水不均等情况，仍可能会导致最终模型制备的不充分，产生较大的个体差异。针对此种情况，一是可以通过延长造模时间加以改进，比如赵慧颖等通过实验证明，大鼠饮用加入L-NAME 的饮用水后自第3 d起，经尾动脉血压测量显示，大鼠尾动脉血压不断增高，直到第8 周时尾动脉血压值才达到最高[26]；二是可以改变大鼠摄入药物的方式，比如学者刘妍妍等通过腹腔注射的方法成功诱导了妊娠高血压大鼠模型[27]；黄自通等通过使用L-NAME 灌胃的方法成功诱导大鼠高血压模型[4]。总而言之，各种造模方法均各有其利弊，须取长补短，加以改进，才能打造出更加完备的高血压动物模型。

综上所述，制备完善、便捷、高效的高血压模型对开展相关疾病研究具有重要意义，目前的造模方法虽各有其局限性，但打造出与临床症状吻合的高血压动物模型指日可待，如何建立更加完备的高血压动物模型需要我们继续共同努力。