‘阳光玫瑰’葡萄锈果品质及显微结构分析

黄艳，刘芳，黄科文，刘磊，梁东，王进，陈洪艳，吕秀兰*

（1. 四川农业大学果蔬研究所，四川成都 611130；2. 成都市农林科学院园艺研究所，四川成都 611130；3. 乐山师范学院，四川乐山 614000；4. 泸定县农业技术推广和土壤肥料站，四川泸定 626100）

果锈是指在果实发育过程中果实表面出现的黄褐色斑痕，是果实成熟时的一种生理紊乱现象，在多种果树中均有发生，如苹果、枇杷、梨和葡萄等[1-4]。果锈的产生是内、外多种因素共同作用引起的。李健花等[5]认为，‘金冠’苹果角质膜破裂与果锈产生密切相关，由于果实表皮细胞角质层破裂，使木栓化程度加深，导致表皮细胞及皮层细胞死亡。在梨果锈的形成过程中，其表面角质膜的变化与‘金冠’苹果十分相似[6]。进一步利用扫描电镜观察沙梨表皮发现，有锈部位的果皮角质膜发生龟裂，在没有角质膜保护的情况下，表皮细胞裸露部位的细胞壁次生加厚[7]。研究发现，‘锈酥’果皮中的木质素含量显著高于‘砀山酥梨’果皮中的木质素含量，表明木质素的积累可能与果锈的产生有关[8]。

冯娇[9]认为，葡萄园内空气湿度过大，不仅影响‘阳光玫瑰’葡萄果实表皮角质层和蜡质层的形成，还会导致角质层产生龟裂，促进果锈产生。娄玉穗等[10]研究发现，在‘阳光玫瑰’的果实表面常形成条状或不规则状锈斑，严重时连成片，致使果实表皮形成木栓化组织，产生锈果[10]。对黄绿色葡萄品种的果锈发生情况调查发现，一般情况下欧亚种比欧美杂交种更易产生果锈；而对欧亚种的调查显示，薄皮品种与厚皮品种相比更易产生果锈，如‘无核白鸡心’‘黄金指’和‘京玉’较易产生果锈[11]。针对‘阳光玫瑰’的研究结果表明，果锈的生成与多酚化合物及其氧化反应有关[12-14]。

众所周知，结构决定着功能，因此果锈的产生与果实细胞结构的变化具有相关性。目前，关于果锈与葡萄果实结构变化相关性的研究鲜有报道。因此，本研究系统分析了‘阳光玫瑰’葡萄有锈果果皮的显微结构及果实品质，为‘阳光玫瑰’葡萄提质增效提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验在四川农业大学现代农业研发基地（30°33'46"N，103°39'36"E）葡萄园进行。以4年生的‘阳光玫瑰’葡萄为试材，株行距为1.5 m×3 m，Y形整形，避雨双膜覆盖栽培。试验园土壤为砂质壤土，常规管理。

1.2 果实理化指标测定

1.2.1 果实外观及基本理化指标的测定

于2019年8月中旬果实成熟时进行采样。从葡萄园内选择10株树势一致、无病虫害、生长健壮的4年生‘阳光玫瑰’葡萄，从每株树上采集部位相近的无果锈（果锈面积=0）和有果锈（果锈面积＞25%）的果实各10粒，共200粒，快速放入冰盒中带回实验室。使用色差仪对果皮颜色进行测定，L*表示颜色亮度，a*和b*表示颜色组成，a*值从负增加到正，颜色由绿变红，而b*值由负增加到正，颜色由蓝变黄。使用百分之一电子天平测定粒质量；用电子游标卡尺测量横纵径，计算果形指数；采用手持式糖度计测定可溶性固形物含量；用酸碱中和滴定法测定可滴定酸含量；用蒽酮比色法测定可溶性糖含量[15]；木质素含量采用试剂盒测定（苏州格锐思生物科技有限公司，G0708F）。

1.2.2 果实糖组分的测定

果实糖组分提取与测定参照胡志群、Chen等[16-17]的方法，并略有修改。将冷冻的葡萄果皮和果肉样品分别在液氮中磨成粉末状，精确称取1.0 g，加入4 mL超纯水，80 ℃水浴15 min，9000 r·min-1，4 ℃离心15 min，取上清液，转移到10 mL容量瓶。重复上述步骤再次提取上清液，超纯水定容到10 mL，获得糖组分提取样液。合并两次提取液，抽取1 mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤后以备上机分析。每个样品均重复3次。糖检测使用的色谱柱为Thermo，0.5 μm NH2柱，检测器RID，以乙腈∶水=8∶2为流动相，流速为0.5 mL·min-1，等度洗脱，柱温为30 ℃，进样量10 μL。根据吸光度值和标品浓度制作标准曲线：

果糖：y＝226229x－958.57（R2＝0.9991）

葡萄糖：y＝194780x＋25802（R2＝0.9990）

蔗糖：y＝201205x＋7113.3（R2＝0.9999）

上述公式中，x为标品浓度，y为吸光度值，根据标准曲线分别计算样品中果糖、葡萄糖和蔗糖含量。

1.2.3 酚类物质（类黄酮类）测定

酚类物质的提取参考严娟等[18]的方法。提取液为70%的甲醇内含2%的甲酸。称取‘阳光玫瑰’葡萄果皮0.2 g，加2 mL提取液在0 ℃下研磨提取，然后转移到离心管中，再加3 mL提取液冲洗研钵后，并入离心管。超声浸提30 min；随后在摇床30 ℃下250 r·min-1震荡2 h，充分提取。8000 r·min-1离心10 min，上清液用0.45 μm的针管滤膜过滤后4 ℃保存，待用。总酚含量的测定使用Folin-Ciocalteu方法，总黄酮含量参考Wang等[19]的方法，总黄烷醇含量参考Fang等[20]的方法，总黄酮醇含量参考Miliauskas等[21]的方法。

1.2.4 酚组分的测定

参考黄胜佳等[22]的方法，略有修改。从-80 ℃冰箱中取出果皮和果肉样品，将其敲碎后混匀，分别取果皮和果肉至研钵中，加入液氮研磨成粉末后，准确称取0.5 g混合样放入5 mL离心管中，避光条件下加入1.5 mL提取液，充分混匀。将离心管放入超声装置中辅助提取30 min后，在4 ℃、5 000 r·min-1条件下离心15 min，吸取上清液。用0.45 μm微孔滤膜过滤，贮存于-20 ℃冰箱中，用于酚的分析。使用安捷伦1260液相色谱仪，Comatex C18色谱柱，柱温30 ℃，进样量20 μL。流动相A为2%甲酸溶液，B为乙腈，梯度洗脱，流速为1 mL·min-1，洗脱程序见表1。

表1 流动相配比与洗脱时间Table 1 Mobile phase ratio and elution time

标准曲线的绘制：用甲醇（色谱纯）将每瓶定量的20 mg标准品分别溶解，定容于25 mL棕色容量瓶中，配制成 800 mg·L-1的标准品母液，全程均为避光处理。将上述母液用流动相分别配制成0.5、1、2、5、10、25、50、100 mg·L-1的浓度梯度，再配制成混合标准溶液，避光保存于-20 ℃以下的环境中[23]。

将上述混合标准溶液进行色谱分析，以标样的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制出9种酚类物质的标准曲线，并且计算出回归方程和相关系数。

没食子酸：y＝39.407x－177.16（R2＝0.9991）

香豆酸：y＝34.514x－50.987（R2＝0.9995）

绿原酸：y＝54.134x＋104.556（R2＝0.9999）

咖啡酸：y＝102.27x－227.73（R2＝0.9992）

丁香酸：y＝56.291x－114.55（R2＝0.9995）

表儿茶素：y＝12.615x－48.155（R2＝0.9993）

阿魏酸：y＝121.64x－179.78（R2＝0.9995）

槲皮苷：y＝56.797x＋29.964（R2＝0.9994）

白藜芦醇：y＝149.75x－223.2（R2＝0.9993）

1.2.5 果皮体式显微镜和石蜡切片观察

采用体式显微镜观察同一成熟时期有果锈和无果锈葡萄果实的果皮特征，并拍照记录。采用石蜡切片法观察同部位果皮结构。分别选取有、无果锈的葡萄果实5～10粒，用双面刀片切取果皮的果锈部位，无果锈果实则选取果实向阳面的果皮，取样厚度0.5 cm左右，立即放入FAA固定液中，经抽气后固定待用。采用石蜡切片法制作切片，切片厚度为10 μm，然后经番红-固绿双重染色进行制片，在光学显微镜下进行果皮垂周面形态观察[24]。

1.2.6 果皮扫描电镜及透射电镜观察

扫描电镜（HITACHI，SU8100）的制样方法参考王一衡和李晓[25-26]的方法。透射电镜（HITACHI，HT7700）的制样方法参考唐国冬等[27]的方法。

1.3 数据分析

试验数据采用Microsoft Excel 2016和Sigma Plot软件进行处理并绘制相关图表，采用SPSS 26.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 成熟期有锈果及无锈果外观品质分析

由表2可知，成熟期无锈果粒质量显著高于有锈果，两者的横径、纵径和果形指数无显著性差异。结果表明，无锈果果皮亮度值（L*）显著高于有锈果果皮，而有锈果的红色饱和度（a*）极显著高于无锈果，黄色饱和度（b*）无显著性差异。

表2 成熟期果实外观品质比较Table 2 Comparison of fruit appearance and quality at mature stage

2.2 成熟期有锈果及无锈果重要内在品质分析

由表3可知，有锈果的可溶性固形物高达22.18%，显著高于无锈果，其可溶性糖、木质素和总酚含量均极显著高于无锈果，两者的可滴定酸、总黄酮、总黄酮醇、总黄烷醇含量无显著性差异。说明糖、木质素和总酚的积累可能与果锈的形成有关。

表3 成熟期果实重要内在品质比较Table 3 Comparison of important intrinsic quality of fruit at mature stage

2.3 成熟期锈果及无锈果糖组分分析

由表4所示，‘阳光玫瑰’有锈果果皮和果肉的果糖、葡萄糖和总糖含量均极显著高于无锈果果皮和果肉，有锈果果皮的果糖、葡萄糖和总糖含量较无锈果果皮分别增加19.79%、14.62%和17.57%，有锈果果肉的果糖、葡萄糖和总糖含量较无锈果果肉分别增加了14.28%、9.50%和11.77%。两者果皮和果肉的蔗糖含量均无显著性差异。说明‘阳光玫瑰’葡萄果实糖分积累与果锈的形成密切相关，其中果糖和葡萄糖积累有利于果锈的产生。

表4 成熟期果实糖组分比较Table 4 Comparison of fruit sugar components at mature stage mg·g-1

2.4 成熟期有锈果及无锈果酚组分分析

通过对成熟期有锈果与无锈果果皮和果肉酚组分的测定发现，有锈果果皮和果肉的酚组分含量与无锈果果皮和果肉的酚组分含量有显著性差异（表5）。有锈果果皮的没食子酸、绿原酸、表儿茶素、阿魏酸、槲皮苷和白藜芦醇含量都极显著高于无锈果果皮，分别高出110.40%、85.06%、88.01%、359.89%、396.73%和40.66%；其咖啡酸含量显著高于无锈果果皮，较无锈果果皮增加了21.93%；无锈果果皮中未检测出丁香酸和香豆酸。有锈果果肉的绿原酸、表儿茶素和咖啡酸含量都极显著高于无锈果果肉，分别高出89.18%、24.30%和8.48%；无锈果果肉中未检测出阿魏酸，所有样品果肉中均未检测到丁香酸、香豆酸、槲皮苷和白藜芦醇。说明‘阳光玫瑰’葡萄酚组分的积累有利于果锈的形成。

表5 成熟期果实酚组分比较Table 5 Comparison of phenolic components at mature stage

2.5 成熟期果皮体式显微镜和石蜡切片观察

由图1（放大25倍）所示，‘阳光玫瑰’葡萄成熟期有锈果与无锈果的果皮表面存在较大差异。无锈果果皮（图1 A）呈黄绿色，表面干净无斑点，而有锈果果皮（图1 B）呈黄色且有成片的红色斑点。

图1 成熟期‘阳光玫瑰’无锈果（A）与有锈果（B）体视显微镜下果皮特征差异（25倍）Figure 1 The difference of pericarp characteristics between none russet (A) and russet (B) 'Shine Muscat' grape at mature stage under stereoscopic microscope (×25)

通过对无锈果与有锈果果皮细胞的石蜡切片观察（放大200倍）发现，‘阳光玫瑰’葡萄果皮主要由角质层细胞和表皮细胞组成。无锈果果皮角质层细胞较小，呈鹅卵石状，排列疏松；表皮细胞呈扁圆形或扁长形，排列紧密，越靠近果肉细胞越大（图2 A）。而有锈果皮无明显的角质层细胞，角质膜结构被破坏（图2 B）。

图2 成熟期‘阳光玫瑰’葡萄无锈果（A）与有锈果（B）果皮石蜡切片（200倍）Figure 2 Paraffin section of pericarp of none russet (A) and russet (B) 'Shine Muscat' grape at mature stage (×200)

2.6 成熟期果皮扫描电镜观察

通过对无锈果与有锈果果皮扫描电镜观察（图3）发现，无锈果果皮（图3 A、B）表皮蜡质层丰富，覆盖面广，分布均匀，结构致密；个别表皮细胞裸露、脱落，蜡质晶体大小均一，致密，排列均匀。有锈果果皮（图3 C、D）表皮蜡质层相对稀疏，局部小面积蜡质脱落，表皮细胞裸露，蜡质层表面较多孔隙，基质稀疏；表皮细胞部分区域脱落，蜡质晶体大小不均一，排列紊乱，局部呈丝状。表明无锈果与有锈果果皮表皮结构存在一定程度差异性，无锈果表皮蜡质结构相对较好。

图3 成熟期‘阳光玫瑰’葡萄无锈果（A、B）与有锈果（C、D）果皮扫描电镜观察Figure 3 SEM observation of pericarp of none russet (A, B) and russet (C, D) 'Shine Muscat' grape at mature stage

2.7 成熟期果皮透射电镜观察

由图4所示，无锈果果皮（图4 A、B）表皮细胞呈中度水肿，细胞膜局部萎缩，细胞壁完整，轻度质壁分离，胞质内细胞器轻度肿胀、局部区域空泡化。线粒体呈轻度肿胀，大部分线粒体膜完整，基质略显变淡；液泡局部破损，其中可见嗜锇颗粒；脂滴较少，叶绿体结构完整，基粒片层结构存在。而有锈果果皮（图4 C、D）表皮细胞呈中重度水肿，细胞膜局部萎缩，细胞壁完整，次生加厚，轻度质壁分离，胞质内细胞器明显肿胀、呈空泡化。线粒体呈中重度肿胀，大部分线粒体嵴消失，部分严重者膜破损，其结构开始破坏，线粒体正逐渐破裂崩解；液泡崩解，细胞器游离，其中可见嗜锇颗粒；脂滴分散、游离，糖萼不连续。以上结果表明，‘阳光玫瑰’葡萄果锈的产生是由于果皮细胞壁次生加厚，细胞膜结构和细胞器受到破坏所导致。

图4 成熟期‘阳光玫瑰’葡萄无果锈（A、B）与有果锈（C、D）葡萄果皮透射电镜观察Figure 4 TEM observation of pericarp of none russet (A, B) and russet (C, D) 'Shine Muscat' grape at mature stage

3 讨论

在梨和苹果上的研究发现，果锈的形成与木质素的积累有关[28]，苯丙烷代谢的次级产物代谢途径参与了果锈形成过程[29]，葡萄果皮酚类物质含量的积累在一定程度上促进了果面锈斑形成[4-5,12-14]。本研究结果表明，‘阳光玫瑰’有锈果果皮的总酚、酚组分（没食子酸、绿原酸、表儿茶素、阿魏酸、槲皮苷和白藜芦醇）含量均极显著高于无锈果果皮，其咖啡酸含量显著高于无锈果果皮，无锈果果皮中未检测出丁香酸和香豆酸。果皮木质素测定表明，有锈果果皮木质素含量极显著高于无锈果，说明果锈的形成与果皮中酚类物质和木质素的积累密切相关，这与前人报道的结果相似[3,7]。本研究还发现，有锈果果皮的可溶性糖都极显著高于无锈果，两者的可滴定酸含量无显著性差异，说明糖组分的积累有利于果锈的形成，具体影响机制还有待深入研究。

果锈的形成伴随着果皮内部结构的变化。研究表明，‘翠冠’梨果锈的形成与果实表皮细胞形状和排列方式密切相关，表皮细胞形状不规整，排列不整齐，角质膜厚薄不均匀，这些都会导致在快速膨大期果实内部细胞膨大速度远远超过表皮细胞时，角质膜发生网状龟裂，在外界雨水等不良环境因子的影响下，表皮细胞受到损害，形成栓化细胞，从而导致果锈形成[30,3]。本研究发现，无果锈的‘阳光玫瑰’葡萄角质层细胞较小，呈鹅卵石状，排列疏松，表皮细胞扁圆形或扁长形，排列紧密；而有果锈的‘阳光玫瑰’葡萄果皮无明显的角质层细胞，角质膜结构被破坏。扫描电镜观察发现，无果锈‘阳光玫瑰’葡萄果皮表皮蜡质层丰富，分布均匀，结构致密，蜡质晶体大小均一，致密，排列均匀；而有果锈‘阳光玫瑰’葡萄果皮表皮蜡质层相对稀疏，蜡质晶体大小不均一，排列紊乱。说明‘阳光玫瑰’葡萄果锈的形成是由于果皮结构受到破坏导致，这与张盼盼[31]在梨上的研究结果相似。

有研究发现，库尔勒香梨有锈斑部位的细胞膜和细胞壁逐渐消失，线粒体、内质网和高尔基体等细胞器逐渐解体，而完好部位的细胞膜和细胞壁完整，细胞内物质没有流失[32]。本研究通过透射电镜观察发现，‘阳光玫瑰’无锈果表皮细胞壁完整，胞质内细胞器轻度肿胀；大部分线粒体膜完整，液泡局部破损，叶绿体结构完整。而有果锈‘阳光玫瑰’葡萄果皮表皮细胞壁次生加厚，胞质内细胞器明显肿胀，大部分线粒体嵴消失，部分结构开始破坏，线粒体正逐渐破裂崩解，液泡崩解，细胞器游离，说明在果锈形成后，表皮细胞结构遭破坏，胞间层的次生保护组织增多，次生组织进一步木栓化，果皮组织细胞壁木质化加厚。在受到内部细胞压力时，细胞容易破裂，这可能就是导致‘阳光玫瑰’葡萄果锈形成的重要原因。

4 结论

果实品质分析发现，‘阳光玫瑰’有锈果果实的可溶性固形物显著高于无锈果，有锈果果皮中果糖、葡萄糖以及总酚、木质素和酚组分的积累较无锈果果皮显著增多。显微结构分析发现，有锈果果皮中无明显的角质层细胞，果锈处果皮角质膜和蜡质层结构出现损坏，胞间层的次生保护组织增多，次生组织木栓化程度高，果皮组织细胞壁木质化加厚，线粒体和液泡结构受损，细胞器游离。因此，‘阳光玫瑰’葡萄果锈的形成虽然影响了外观品质，降低了商品性，但对果实理化指标有明显的提升，果锈不影响内在品质和口感。