基于网络药理学和分子对接技术探讨益气活血方治疗糖尿病肾病的作用机制*

卢洪梅 钟月圆 罗怡钰 杨亚军 阮永队

(广东医科大学,广东 东莞 523808)

糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病最常见、最严重的并发症之一,其发病人数占全球糖尿病患者的20%～40%[1-2]。中药作为DN治疗的主要或者替代疗法具有良好的疗效和广阔的临床应用前景[3-4]。前期研究发现益气活血方治疗DN有着良好临床疗效[5]。全方益气、活血、化瘀,兼补益脾肾,不但能改善患者的肾脏功能、延缓DN发展,而且可以稳定血糖水平,降低糖尿病并发症的发生率。但该方成分多而复杂,其治疗DN的主体成分及作用机制尚不清楚。本研究拟通过中药复方网络药理学及分子对接技术,分析自拟益气活血方在治疗DN中的有效活性成分、潜在作用靶点及作用机制,旨在为 DN 的临床治疗提供新的治疗思路。

1 材料与方法

1.1 自拟益气活血方中活性成分的获得 益气活血方组成:黄芪30 g,山药30 g,五指毛桃30 g,菟丝子 20 g,补骨脂20 g,桃仁20 g,丹参15 g,三七15 g,益母草15 g。在 TCMSP 数据库中进行检索药物活性成分,口服生物利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%、类药性(Drug-likeness,DL)≥ 0.18为筛选条件,获得其活性成分。应用ETCM 数据库进行检索以补充未检索得到的获得其化学成分。通过PubChem数据库获取ETCM数据库中所得化学成分的SDF分子结构,将其导入SwissADME数据库中获得该中药的有效活性成分。

1.2 预测自拟益气活血方的作用 靶点通过PubChem数据库获取上述步骤中所得各活性成分的SDF分子结构,利用SwissTargetPrediction 数据库获得各活性成分所对应的靶点。选择 Probability≥0.15 的靶点作为成分靶点,并通过查阅相关文献对成分靶点进行补充[6]。

1.3 DN疾病靶点的获得运用 TCMSP 数据库、DisGeNEt 数据库、TTD 治疗目标数据库、 GeneCards 人类基因数据库、 OMIM 在线孟德尔遗传数据库(https://omim.org/)、 DrugBank 数据库共6个数据来源,同时依据已有文献未预测到的疾病靶点进行补充,确定最终的DN疾病靶点。将成分靶点与疾病靶点取交集,绘制药物-疾病交集靶点维恩图。

1.4 构建交集靶点PPI网络以筛选核心靶点 运用Cytoscape 3.7.0 中的 BisoGenet 插件构建蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein interaction,PPI)网络。使用Cytoscape软件的analyze network功能和 CytoNCA 插件计算分析交集靶点 PPI 的网络拓扑学特征属性值,对该网络进行中心性分析,得到核心靶点和关键靶点。

1.5 交集靶点与核心靶点的GO功能与KEGG通路富集分析 将交集靶点导入生物学信息注释数据库 Metascape ,进行生物信息富集分析,包括生物过程(Biological processe,BP)、分子功能(Molecular function,MF)和细胞组分(Cell componen,CC)以及KEGG信号通路富集分析。

1.6 构建“活性成分-交集靶点”与“功能-交集靶点-通路” 网络使用 Cytoscape 3.7.0 构建自拟益气活血方“活性成分-靶点”网络,达到可视化的目的。分析其网络特征参数,包括连接度(Degree)、介度(Betweenness)、紧密度(Closeness)等,以探究自拟益气活血方中活性成分与靶点之间的关系。

1.7 关键靶点与主要活性成分的分子对接分析 应用PDB数据库、PubChem 数据库中检索并下载关键靶点、活性成分的3D结构文件。使用Autodock Tools1.5.6 和Autodock Vina1.1.2软件进行分子对接,通过分子可视化软件PyMol 2.4.0与R4.1.1分别绘制示意图及结果热图。

2 结果

2.1 自拟益气活血方活性成分及靶点的获取分析 初步获得益气活血方的化学成分共691种,重要活性成分114种,其中黄芪20种,山药6种,菟丝子11种,桃仁6种,丹参30种,三七4种,益母草8种,五指毛桃16种,补骨脂13种。对得到的成分靶点去重,获得预测靶点223个。见表1。

表1 益气活血方主要活性成分信息Table 1 Information on active components of Yiqi Huoxue Prescription

2.2 获取DN相关靶点 通过TCMSP数据库得到DN疾病靶点4个,DisGeNEt 数据库得到靶点206个,TTD 数据库得到点7个,通过 GeneCards 数据库得到880个,通过 OMIM 数据库得到77个,通过 DrugBank 数据库得到44个。将得到的靶点通过 Uniport 数据库将基因名称标准化。将标准化的基因名称汇总、去重,共获得 DN 相关靶点1002个,交集靶点81个,见图1。

图1 益气活血方成分靶点与DN疾病靶点的交集韦恩图Figure 1 Venn diagram of Yiqi Huoxue Prescription targets and Diabetic Nephropathy targets

2.3 构建交集靶点 PPI 网络以筛选关键靶点 构建自拟益气活血方与 DN 的 PPI 网络。利用 PPI 的网络拓扑学特征属性值的相关中位值为筛选标准,进行两次筛选,得到374个核心靶点。同时,核心靶点与上述得到的交集靶点取交集,得到15个关键靶点。见图2。

图2 益气活血方治疗DN的核心靶点Figure 2 Hub protein in treatment of Diabetic Nephropathy by Yiqi Huoxue Prescription注:A.益气活血方核心靶点的筛选策略示意图;B.益气活血方治疗DN的374个的核心靶点网络图。CC.紧密度中心性;DC.连接度中心性;BC.介度中心性。

2.4 交集靶点与核心靶点的GO和KEGG富集分析 通过 Metascape 对自拟益气活血方治疗 DN 的交集靶点进行生物功能分析,并将logP 值排名前10的条目绘成气泡图进行可视化。结果表示自拟益气活血方通过多靶点-多通路来达到治疗 DN 的目的。见图3。

图3 益气活血方治疗 DN 交集靶点的富集分析结果图Figure 3 Enrichment analysis result charts of intersection targets in treatment of Diabetic Nephropathy by Yiqi Huoxue Prescription注:A.交集靶点在分子功能 (MF)、生物过程(BP)和细胞组分 (CC)的 GO 分析气泡图;B.交集靶点KEGG通路富集分析气泡图。

2.5 构建“活性成分-交集靶点”与“功能-交集靶点-通路”网络 利用 Cytoscape 3.7.0 绘制并分析自拟益气活血方中的“活性成分-交集靶点”与“功能-交集靶点-通路”的关系网络,见图4。

图4 益气活血方可视化网络图Figure 4 Visual network of Yiqi Huoxue Prescription注:A.益气活血方的活性成分-交集靶点网络图,其中 DS、 BGZ、 WAMT、SY、TSZ、TR、HQ、SQ、YMC 分别是丹参、补骨脂、五指毛桃、山药、菟丝子、桃仁、黄芪、三七、益母草的简写;B.益气活血方治疗 DN 的功能-交集靶点-通路网络。

2.6 关键靶点与重要活性成分的分子对接分析 将得到的15个关键靶点与“活性成分-交集靶点”网络中度值前15的活性成分逐个进行分子对接(见图5 A)。最低结合效能小于-5 kcal/mol的结果有198对。本自拟益气活血方活性成分与AKT1、 PARP1、 PTPN11亲和力均较好,见图5B～D。

图5 益气活血方核心活性成分与关键靶点分子对接可视化Figure 5 Visualization of docking between active molecules of Yiqi Huoxue Prescription and key target molecules注:A.核心化合物和关键靶点的分子对接热图;B.山萘酚与靶点 PTPN11 的分子对接;C.木犀草素与靶点 AKT1 的分子对接;D.槲皮素与靶点 PARP1 的分子对接。

3 讨论

DN的发病机制是复杂和多因素的,包括遗传、代谢和血流动力学等因素[7-8]。特定代谢驱动的葡萄糖依赖性途径和各种血管活性激素途径在糖尿病肾组织内被激活,各种途径和介质之间存在大量重叠的相互作用是DN发病机制仍未被完全了解的重要原因[9-10]。由于临床治疗中的主要方法具有局限性,而黄芪、山药、丹参、菟丝子、三七、益母草等中药可通过多途径减少炎症反应的发生从而改善DN患者的肾脏功能,由此DN可能需要靶向这种疾病多种相关介质以协同治疗。在本自拟益气活血方的网络药理学研究中,我们得到该处方对于DN具有治疗作用的重要活性成分、靶点和富集通路,并对其中的关键靶点及其作用机制进行分析。

益气活血方主要活性成分为黄酮类化合物,包括山柰酚、木犀草素、槲皮素、异鼠李素、芹菜素、金和欢素、补骨脂异黄酮醛等。相关研究[11-12]表明,天然黄酮类化合物具有多种作用机制,包括抗氧化应激、改善血糖血脂紊乱、抗炎、抗凋亡、调节血管舒张及改善血流动力学异常等,可以预防和治疗DN。在益气活血方中,异鼠李素、槲皮素、芹菜素和木犀草素共同作用,通过抑制炎症和消除自由基来治疗DN[13-14]。黄芪、菟丝子、益母草、五指毛桃中的共有成份山柰酚可以通过增强GLP-1、胰岛素的释放和Rho激酶的抑制来改善肾损伤并减少纤维化[15]。花生四烯酸可以调节细胞内抗氧化能力、肾小球高通率正常化和内皮糖黄质的恢复,从而治疗DN[16]。而棕榈酸、a1-谷甾醇、补骨脂异黄酮醛等活性成分的具体作用机制需要进一步实验研究验证。

胰岛素受体酪氨酸磷酸化是糖代谢的重要因素[17]。Akt是一个重要介质,可以调节葡萄糖代谢和基质上调。益气活血方的靶点PTPN1和PTPN11可以调节胰岛素抵抗下游信号蛋白IRS-1的磷酸化,同时ESR1和PPARG等关键靶点也参与了胰岛素抵抗的调节[18-19]。在DN病理机制的研究中,PARP1和PIK3R1等靶点被发现与自噬有关[20]。同时,STAT3和GSK-3β等靶点也与肾纤维化相关[21]。益气活血方还具有调节炎症的作用,可以调节NF-κB1、AP-1、PARP1等靶点来抑制促炎因子的诱导[22]。在临床研究中,一些趋化因子及其受体、细胞因子、NF-κB1、PI3K-Akt和JAK-STAT通路的相关制剂显示出显著的疗效。

GO和KEGG富集分析结果显示,益气活血方治疗DN主要通过调节胰岛素抵抗、EGFR酪氨酸激酶抑制剂抗性、脂质和动脉粥样硬化以及PPAR信号通路等几个信号通路发挥作用。在这些通路中,本处方的活性成分通过与关键靶点的结合发挥作用。其中,mTOR被认为是DN中最关键的自噬调节剂之一[23],本处方可通过调节mTOR信号通路预防DN的发生和进展。此外,PPAR信号通路可抑制炎症反应,并通过PI3K-AKT通路、瘦素通路和脂联素通路来增加外周组织对胰岛素的敏感性,从而改善胰岛素抵抗,进而实现对糖代谢的调节[24]。虽然已有多篇文献报道了该方剂的活性成分与关键靶点的结合性,但部分活性成分与关键靶点的相互作用仍需进一步研究。

总之,本研究应用网络药理学及分子对接相关理论初步探究了该自拟益气活血方治疗DN的作用机制。网络药理学研究是基于现有的实验研究及数据而进行的建模,其结果与实际效果可能存在一定偏差。该研究中,即使分子对接结果显示该方剂的多种活性成分对多个DN靶点具有较好的亲和力,但其作用机制却鲜有研究报道。具体作用机制还需进一步的实验研究分析,以对其疗效进行验证。因此,望本研究可为今后的深入研究提供理论基础,为DN的治疗提出新的治疗思路。

4 结论

益气活血方可能通过调节炎症与细胞自噬、促进ECM蛋白的降解、调节外周组织对胰岛素的敏感性及胰腺β细胞的增殖和凋亡等作用机制达到治疗DN的作用。