NLRP3炎性小体在心脏病发病中的作用研究进展

高 源，郑 刚*，齐 靖，张 凤

(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712000；2.陕西中医药大学第二附属医院 科研科，陕西 咸阳 712046)

炎性级联反应在心脏病发病中扮演重要角色,抑制炎性反应可有效治疗心脏病[1]。炎性小体是多种蛋白质复合物,在炎性反应中处于关键位置,可以募集相关炎性细胞诱发炎性级联反应。目前发现的炎性小体主要有Nod样受体热蛋白结构域相关蛋白(Nod-like receptor pyrin domain-containing protein,NLRP)NLRP1、NLRP3、NLRC4、NLRP6、AIM2及Pyrin等。对NLRP3的研究较深入,其可以与ASC及pro-caspase-1形成炎性体,并进一步引导IL-1β和IL-18炎性介质的成熟和分泌,诱发炎性反应。激活NLRP3炎性小体是诱发心脏病的主要因素,抑制其激活,可能是未来治疗心脏病的潜在干预靶点[2]。

1 NLRP3炎性小体概述

NLRP3炎性小体由Nod样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、凋亡相关的斑点蛋白(apoptosis related spot protein,ASC)和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1(caspase-1)组成[3]。NLRP3包含3个结构域:C端富含亮氨酸重复序列(leucine-rich-repeats,LRRs)、中心核苷酸结合寡聚结构域(nucleotide-binding and oligomerization domain,NACHT),以及热蛋白结构域(N-terminal pyrin domain,PYD)。正常生理条件下NACHT与 LRRs 结合使NLRP3炎性小体处于抑制状态。NLRP3炎性小体激活后促进pro-caspase-1成熟为具有活性的caspase-1。caspase-1一方面是IL-1β、IL-18转化酶,可将pro-IL-1β、pro-IL-18裂解为具有活性形式IL-1β、IL-18,另一方面通过促进膜穿孔蛋白D(gasdermin-D,GSDMD)活化引导细胞焦亡[4]。

1.1 NLRP3炎性小体的激活

NLRP3激活的起始步骤是模式识别受体发出的“启动”信号,通过NF-κB激活从而导致NLRP3、pro-IL-1β和pro-IL-18的过度表达。“启动”之后使NLRP3激活,其分子机制尚不完全清楚,目前主要有4种观点[5]。

1.1.1 K+外流与NLRP3 炎性小体的激活:NLRP3炎性小体激活需要细胞质中K+外流,约50%细胞内K+外流可引起ATP激活,并通过嘌呤离子通道型7(purinergic ionotropic,P2X7)受体激活NLRP3炎性小体。尼日利亚霉素是一种K+载体,可导致膜孔形成,从而触发K+外流激活NLRP3炎性小体。降低细胞内K+足以在体外诱导NLRP3炎性小体激活。相反,通过K+通道抑制剂格列本脲阻断K+外流或增加细胞外K+浓度均可抑制NLRP3炎性小体激活[5]。

1.1.2 Ca2+信号失调与 NLRP3 炎性小体激活:NLRP3激活与细胞内Ca2+储存和释放有关,多种NLRP3激活剂可调控Ca2+信号调控。降低细胞内储存的Ca2+及抑制细胞外Ca2+内流,从而抑制NLRP3激活[6]。

1.1.3 线粒体功能失调和活性氧(reactive oxygen species,ROS)与 NLRP3 炎性小体激活:已知的NLRP3激活剂都会产生ROS,ROS清除剂可抑制NLRP3炎性小体激活。ROS水平增加是NLRP3激活的必要条件,线粒体是NLRP3激活的主要ROS来源,线粒体DNA和线粒体外膜蛋白电压依赖性阴离子通道(mitochondrial outer membrane protein voltage dependent anion channel,VDAC)对于线粒体产生ROS都是必不可少的。VDAC表达减少的细胞对NLRP3激活剂的活化受到抑制[7]。

1.1.4 溶酶体破裂与 NLRP3 炎性小体激活:细胞吞噬结晶样物质而不能将其溶解时会导致溶酶体损伤和破裂,进而促使溶酶体组织蛋白酶B的释放并激活细胞质中NLRP3炎性小体,提示组织蛋白酶B可能作用于NLRP3炎性小体本身或者切割NLRP3炎性小体某一部分从而触发其激活[8]。

2 NLRP3炎性小体与心力衰竭的关系

NLRP3炎性小体在心力衰竭(heart failure,HF)的发病和预后中起着重要作用[9]。有报道,随着心肌肥厚、炎性反应和心室扩张,血清中NLRP3 mRNA水平升高。基因消融NLRP3或给予IL-1β受体拮抗剂可以减轻心脏炎性反应并挽救心肌收缩功能障碍。雷公藤内酯醇可通过抑制NLRP3炎性小体来减轻HF小鼠的心肌重塑和改善心功能。格列本脲抑制NLRP3炎性小体可改善心肌收缩功能障碍[10]。

HF患者血清中NLRP3、caspase-1和IL-1β水平随心功能的严重程度而逐级增高。NLRP3水平与NT-proBNP水平及单核细胞计数直接相关,与左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)呈负相关。HF患者的IL-1β和IL-18升高,其活性与HF症状和预后相关[11]。IL-1β和IL-18抑制心肌细胞收缩和对肾上腺素能受体刺激的敏感性。通过降低IL-1β或IL-18活性或阻断IL-1β的下游信号转导更有利于改善HF患者临床症状与预后。IL-1β抑制剂(IL-1βRa或canakinumab)在早期临床试验中被证明对射血分数保留性心力衰竭或射血分数减低型心力衰竭患者有效[12]。一项涉及54例HF患者的临床试验报告中显示,与对照组相比,运动组的caspase-1募集域(apoptosis-associated speck-like protein with a caspase recruitment domain,ASC)甲基化增加,血浆IL-1和ASC mRNA水平降低,表明运动通过ASC的表观遗传调节促进HF更好的结局[13]。心脏重塑和纤维化是HF发展的主要机制,成纤维细胞在NLRP3炎性小体激活过程中也表现出更早和更显著的活动,抑制NLRP3炎性小体活化可以逆转心肌纤维化过程,从而影响HF的发病过程。

3 NLRP3炎性小体与动脉粥样硬化的关系

炎性反应可导致动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)斑块不稳定和破裂,进而引发急性冠脉综合征。慢性炎性反应可导致AS血栓形成的各个阶段,包括早期斑块形成、斑块生长以及心肌梗死、卒中和心血管事件发生前的急性斑块破裂[14]。

NLRP3炎性小体通过模式识别受体相关信号通路参与AS的炎性反应过程。NLRP3炎性小体在AS中的重要作用,使用低密度脂蛋白受体(LDLR-)缺陷小鼠高脂饮食8周后,NLRP3、ASC、IL-1和IL-18表达水平降低,AS病变减弱。还发现IL-18结合蛋白不仅可以减弱主动脉斑块形成进程,还可以减少病变中的淋巴细胞浸润和脂质含量,从而对动脉粥样硬化起到保护作用[15]。

ROS在氧化应激和AS斑块形成过程中起着重要作用,ROS的过度生成诱导凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(low-density lipoprotein receptor-1,LOX-1)的表达,LOX-1是免疫系统的有效调节因子,并在AS的发展中起重要作用。在培养的人巨噬细胞THP-1暴露于脂多糖显著诱导LOX-1和ROS的表达,并引发线粒体DNA损伤,导致细胞自噬并激活NLRP3炎性小体。用结合抗体或siRNA抑制LOX-1可阻止随后的一系列事件。ROS抑制剂和自噬诱导剂都降低了NLRP3炎性小体的表达。DNA酶Ⅱ siRNA转染实验也证实LOX-1介导的自噬和线粒体DNA损伤在多种心血管疾病发病中NLRP3炎性小体激活起着重要作用的假说[16]。

4 NLRP3炎性小体与心肌梗死的关系

炎性反应在心肌梗死后组织损伤和修复的程度方面也起着重要作用。IL-1β受体拮抗剂anakina抑制IL-1β活性可显著降低小鼠急性心肌梗死后的心肌肥厚和心肌功能障碍[17]。

NLRP3炎性小体识别各种危险信号并诱导无菌炎性反应,在缺血性心肌病发病中可大量激活。有报道,siRNA或药理学抑制剂抑制NLRP3和P2X7受体可防止炎性体激活并减少心肌细胞死亡,减轻小鼠冠状动脉结扎后的心脏重塑。NLRP3炎性小体抑制剂MCC950在经腔球囊闭塞诱导的心肌梗死猪模型中减少了梗死面积,表明抑制NLRP3炎性小体激活可能对急性心肌梗死患者具有治疗潜力[18]。

在心肌缺血/再灌注损伤的大鼠模型中,NLRP3的表达上调,caspase-1活性增强,IL-1β和IL-18增加,抑制NLRP3激活可减少梗死面积。心肌内注射NLRP3 siRNA或腹腔内注射炎性体抑制剂BAY-11-7028可减轻小鼠心脏中巨噬细胞和中性粒细胞的浸润,并减少心肌缺血/再灌注损伤[19]。

5 NLRP3炎性小体与心脏重构的关系

心脏重塑导致心脏结构和功能一系列变化,心室重构的主要原因,例如压力超负荷(主动脉瓣狭窄和高血压)、容量超负荷(瓣膜返流和缺血)和其他疾病(如心肌梗死、心肌炎、扩张型心肌病和瓣膜性心脏病)的适应性反应,这些疾病逐渐导致心脏进行性失代偿。半胱天冬酶激活和募集结构域3(CARD3)是心肌梗死后左心室重构和功能障碍的积极调节剂,并且CARD3在调节一些细胞系中的半胱天冬酶-1活性中起着关键作用[20]。

尽管可以成功开通冠脉和适当的药物治疗以及改变生活方式,但是心脏重构仍然很常见,并最终导致心力衰竭和死亡。心肌坏死会触发炎性因子的产生,如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-18、IL-33和C-反应蛋白,抑制这些炎性因子的产生可调节心肌重塑。诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)调节生物活性NO的产生,NO是NLRP3炎性小体激活的关键负调节因子之一。在心衰患者中,iNOS在巨噬细胞和心肌细胞中都有高表达。在iNOS敲除的慢性心衰(chronic heart failure,CHF)小鼠,其存活率、左心室功能、肥大、纤维化和炎性反应激活方面表现出显著改善,表明iNOS负责缺血性心衰的全身炎性反应和心脏重塑。线粒体参与多种细胞生命活动,如能量、信号、细胞增殖、分化和凋亡,线粒体损伤释放的线粒体DNA可激活NLRP3炎性小体。在高脂饮食和低剂量链脲佐菌素诱导的T2D大鼠中,NLRP3基因沉默疗法可改善心脏炎性反应、纤维化和心功能不全。在一些实验动物模型中,NLRP3炎性小体信号干预也被证明可以减少心肌梗死面积并抑制心脏重构和改善心功能[21]。

6 NLRP3炎性小体与心律失常的关系

有报道,在野生型和NLRP3纯合子敲除(NLRP3-/-)的小鼠喂养高脂饮食或正常饮食。与正常饮食喂养的野生型小鼠相比,高脂饮食喂养的野生型小鼠更容易发生心律失常,且炎性反应越剧烈心律失常持续时间越长。相反,高脂饮食喂养的NLRP3-/-小鼠发生心律失常的情况较少。NLRP3 炎性小体激活可引起超快速延迟整流K+通道的上调,缩短导致心肌电位不应期和动作电位持续时间,这是促进心脏电重构的两个关键因素。在高脂饲料诱导的野生型小鼠中,促纤维化信号和纤维化增加以及肌浆网异常Ca2+释放与心律失常发生密切相关。相反,高脂饮食喂养的小鼠中NLRP3-/-的敲除阻止了K+通道的上调和电重构的演变、促纤维化基因的上调以及高脂饲料诱导的野生型小鼠中异常的肌浆网 Ca2+释放,这些结果提示NLRP3炎性小体激活可能是心律失常发生发展的关键驱动因素[22]。

心肌梗死后常伴有室性心律失常,表明炎性反应与此密切相关。钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制物1(CaMK2N1)主要在心肌细胞中表达,并抑制梗死边缘区CaMKⅡδ的磷酸化。与野生型同窝小鼠相比,Camk2n1敲除小鼠表现为心肌梗死后心功能不全加重、纤维化面积增大、室性早搏发生率增高、室性心动过速或室颤易感性增高。NLRP3炎性小体的过度激活导致心肌梗死,Camk2n1小鼠的炎性反应加剧,从而导致心脏重构。更重要的是,体内和体外实验均证实,在,Camk2n1小鼠中NLRP3炎性小体激活通过CaMKⅡδ-p38/JNK途径加剧心律失常的发生发展[23]。以上结果均提示NLRP3 炎性小体激活及其下游炎性因子释放增加与心脏电活动改变密切相关,抑制炎性反应有可能成为心律失常治疗的潜在靶点。

7 问题与展望

NLRP3炎性小体激活对于心脏疾病发病至关重要,抑制NLRP3炎性小体及下游炎性因子IL-1β和IL-18的激活可以阻止心脏疾病的发生发展。NLRP3炎性小体可被多种信号系统激活,其分子机制迄今仍不明确。目前认为抑制NLRP3炎性小体激活最有希望的治疗方法是抗IL-1、抑制caspase-1和P2X7受体拮抗剂。针对NLRP3炎性小体的组装和激活进行靶向治疗可能是心脏疾病未来的一个有效新疗法。