红景天苷调节miR-26a-5p/JAG1/Notch-1信号轴对瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学功能的影响

蔡翔 何亚男 李伶华 邱百怡 秦宗碧

瘢痕疙瘩(keloid disease,KD)是皮肤伤口在愈合过程中过度生长的瘢痕组织,是一种特殊的病理学瘢痕,病因不明,组织学特点为瘢痕过度形成、成纤维细胞过度增殖、细胞外基质成分过度沉积[1]。临床上KD表现为瘢痕超出原始损伤范围,成持续性生长肿块,可伴有瘙痒或疼痛[2]。红景天苷(salidroside,SAL)是从景天科景天属植物红景天全草或根茎中提取出的主要活性成分之一,现代药理学研究表明SAL具有抗氧化、抗疲劳、抗炎、抗肿瘤、调节免疫和神经保护等功能[3,4]。SAL对皮肤也具有保护作用,研究发现SAL具有抗皮肤光老化、促进皮肤创面愈合修复、治疗黄褐斑、痤疮等皮肤病等功效[5,6]。有证据表明,非编码RNA能够参与KD进展,而微小RNA是一类重要的非编码RNA,在细胞增殖、迁移、凋亡中具有调控作用[7]。miR-26a-5p作为miRNA大家族的一员,是肿瘤抑制基因,具有阻断细胞周期和细胞增殖的作用。研究发现JAG1在KD成纤维细胞中显著高表达,且是Notch的配体之一,JAG1/神经源性基因Notch同源蛋白1(Notch-1)信号通路能够促进细胞增殖转移、抑制细胞凋亡等生物学功能[8]。本研究培养原代HKF细胞,探究SAL通过调节miR-26a-5p/JAG1/Notch-1信号轴对HKF细胞生物学功能的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 红景天苷(≥98%)购自于上海源叶生物有限公司;DMEM高糖培养基、胰酶、胎牛血清购自海碧云天生物技术有限公司;青、链霉素购自Gibco公司;BCA蛋白定量试剂盒、Trizol试剂购自康为世纪生物科技有限公司;逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司;CCK-8试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒、Transwell小室购自北京索莱宝生物科技有限公司;JAG1、Notch-1、GAPDH一抗及相应二抗购自CST公司。

1.2 细胞培养 KD标本来自我院术中切除的KD组织,将KD标本使用PBS洗涤,剪去表皮、皮下组织和脂肪等,并切成2 mm3左右小块,采用组织块贴壁法对HEK细胞原代培养,置于含10%体积分数胎牛血清的DMEM高糖培养基中,并加入青、链霉素,在37℃、5% 体积分数CO2的细胞培养箱中培养。待原代细胞生长至铺满细胞皿底部时,加入PBS轻轻晃动使组织块脱落,加入胰蛋白酶进行消化、传代。传3代后取对数生长期细胞用于实验。

1.3 细胞转染与分组 将细胞以5×105个/孔密度接种于6孔板,孵育过夜。将HEK细胞随机分为对照组(Control组)、SAL低浓度组(SAL-L组,50 μmol/L)、SAL高浓度组(SAL-H组,100 μmol/L)、SAL高浓度+miR-NC组(SAL-H+miR-NC组)、SAL高浓度+miR-26a-5p mimics组(SAL-H+miR-26a-5p mimics组)、SAL高浓度+NC-inhibitor组(SAL-H+NC-inhibitor组)、SAL高浓度+miR-26a-5p inhibitor组(SAL-H+miR-26a-5p inhibitor组)。SAL药物浓度参考实验室前期实验结果设置。SAL-H+miR-NC组、SAL-H+miR-26a-5p mimics组、SAL-H+NC-inhibitor组和SAL-H+miR-26a-5p inhibitor组细胞进行相应转染,转染24 h后加入100 μmol/L SAL进行干预24 h。

0 h 24 h

1.4 CCK-8法检测细胞增殖 取对数生长期细胞以1×105个/ml接种在96孔板中,每组设6个复孔。每组细胞进行相应转染与加药后,分别培养12 h和24 h后弃去培养基,每孔加入10 μl的CCK-8溶液,用酶标仪检测每个孔在450 nm波长(OD450)下的光密度。

1.5 划痕实验检测细胞迁移 将对数生长期细胞以5×105个/孔密度接种于6孔板,按1.3进行相应处理后,使用100 μl移液枪吸头在约100%汇合的细胞单层上划痕。PBS洗涤后加入不含血清的培养基,24 h后在显微镜下拍照,用图像分析仪测量划痕宽度。

1.6 Transwell实验检测细胞侵袭 调整HKF细胞密度为1×106个,并接种在6孔板中,按方法1.3进行分组与处理。培养48 h后消化细胞,加入无血清培养基配制成1×104个/ml的细胞悬液。Transwell小室置于24孔板中,分别加入20 μl 1 mg/ml的Matrigel基质胶进行包被,在上室加入200 μl细胞悬液,下室加入含10%胎牛血清的DMEM培养基600 μl。将其置于细胞培养箱中培养20 h,随后用棉签除去室内细胞,加入4%多聚甲醛固定20 min,加入0.1%结晶紫染色10 min,在光镜下观察穿过小室基底膜的细胞数。

1.7 流式细胞术检测细胞周期与细胞凋亡 1.3中处理过的各组细胞加入胰酶消化,离心弃去上清液收集细胞。调整细胞悬液的密度为1×106个/ml,加入70%乙醇在4℃下固定24 h,之后离心弃去上清,加入PBS洗涤2次。加入碘化丙啶(PI)试剂,在暗处避光37℃孵育30 min,用流式细胞仪检测细胞周期。另取重悬细胞,离心沉淀后加入结合缓冲液重悬,加入5 μl Annexin V-FITC试剂和10 μl PI,混匀后室温避光孵育20 min,用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.8 RT-qPCR法检测细胞miR-26a-5p、JAG1和Notch-1 mRNA的表达 细胞经1.3处理后,加入Trizol试剂用于提取细胞RNA。将提取的RNA按逆转录试剂盒说明书操作,逆转录为cDNA,并以此为模板,进行PCR扩增。反应条件：95℃预变性10 min,95℃变性20 s,60℃退火55 s,72℃延伸15 min,共循环50次。2-ΔΔCt方法计算各组细胞miR-26a-5p、JAG1、Notch-1 mRNA的表达量。见表1。

表1 引物序列设计

1.9 Western blot检测细胞JAG1、Notch-1蛋白的表达 细胞经1.3处理后,加入PIPA裂解液提取HKF细胞总蛋白,使用BCA试剂盒测定蛋白质浓度。蛋白质样品进行SDS-PAGE凝胶电泳,随后被转移到PVDF膜上。在室温下将膜在脱脂奶粉中封闭2 h,随后在4℃下与一抗JAG1(1∶1 000)、Notch-1(1∶1 000)孵育过夜。次日室温下将膜与相应二抗(1∶2 000)孵育2 h,再用TBST洗涤膜3次,加入ECL显色剂进行显色。以GAPDH为内参,使用凝胶图像处理系统分析目标蛋白的灰度值。

1.10 双荧光素酶实验检测miR-26a-5p与JAG1的靶向关系 利用TargetScan网站对miR-26a-5p与JAG1的靶向关系进行预测。构建JAG1野生型质粒(JAG1-WT)和突变型质粒(JAG1-MUT),将JAG1-WT和JAG1-MUT分别与miR-NC或miR-26a-5p mimic共转染于HKF细胞,48 h后检测荧光素酶活性。

2 结果

2.1 7组HKF细胞增殖情况比较 7组12 h OD450值比较均无差异(P>0.05)。与Control组相比,SAL-H组HKF细胞OD450值(24 h)显著降低(P<0.05)。与SAL-L组相比,SAL-H组HKF细胞OD450值(24 h)显著降低(P<0.05)。与SAL-H组和SAL-H+miR-NC组相比,SAL-H+miR-26a-5p mimics组HKF细胞OD450值(24 h)显著降低(P<0.05)。与SAL-H+NC-inhibitor组相比,SAL-H+miR-26a-5p inhibitor组细胞OD450值(24 h)显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 7组细胞增殖情况比较

2.2 7组HKF细胞迁移能力比较 与Control组和SAL-L组相比,SAL-H组HKF细胞迁移距离显著降低(P<0.05);与SAL-H组和SAL-H+miR-NC组相比,SAL-H+miR-26a-5p mimics组HKF细胞迁移距离显著降低(P<0.05);与SAL-H+NC-inhibitor组相比,SAL-H+miR-26a-5p inhibitor组HKF细胞迁移距离显著升高(P<0.05)。见图1,表3。

表3 7组HKF细胞迁移能力比较 n=6,μm,

2.3 7组HKF细胞侵袭能力比较 与Control组和SAL-L组相比,SAL-H组侵袭细胞减少(P<0.05);与SAL-H组和SAL-H+miR-NC组相比,SAL-H+miR-26a-5p mimics组侵袭细胞减少(P<0.05);与SAL-H+NC-inhibitor组相比,SAL-H+miR-26a-5p inhibitor组侵袭细胞增多(P<0.05)。见表4,图2。

图2 Tanswell实验检测7组HKF细胞侵袭(结晶紫染色×100)

表4 7组HKF细胞侵袭能力比较 n=6,个,

2.4 SAL对7组HKF细胞周期和凋亡率的影响 与Control组和SAL-L组相比,SAL-H组HKF细胞G0/G1期细胞比例显著增加(P<0.05),S期细胞比例显著减少(P<0.05),G2/M期无显著性变化(P>0.05),细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。与SAL-H组和SAL-H+miR-NC组相比,SAL-H+miR-26a-5p mimics组HKF细胞G0/G1期细胞比例显著增加(P<0.05),S期细胞比例显著减少(P<0.05),G2/M期无显著性变化(P>0.05),细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。与SAL-H+NC-inhibitor组相比,SAL-H+miR-26a-5p inhibitor组HKF细胞G0/G1期细胞比例显著减少(P<0.05),S期细胞比例显著增加(P <0.05),G2/M期无显著性变化(P>0.05),细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。见表5,图3、4。

图3 流式细胞术检测HKF细胞的细胞周期变化

图4 流式细胞术检测HKF细胞凋亡

表5 SAL对7组HKF细胞周期和细胞凋亡率的影响 n=6,%,

2.5 7组HKF细胞miR-26a-5p、JAG1和Notch-1 mRNA的表达比较 与Control组和SAL-L组相比,SAL-H组HKF细胞miR-26a-5p表达显著升高,差异均有统计学意义,JAG1和Notch-1 mRNA表达显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与SAL-H组和SAL-H+miR-NC组相比,SAL-H+miR-26a-5p mimics组HKF细胞miR-26a-5p表达显著升高,JAG1和Notch-1 mRNA表达显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与SAL-H+NC-inhibitor组相比,SAL-H+miR-26a-5p inhibitor组HKF细胞miR-26a-5p表达显著降低,JAG1和Notch-1 mRNA表达显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 7组HKF细胞miR-26a-5p、JAG1和Notch-1 mRNA的表达 n=6,

2.6 7组HKF细胞JAG1和Notch-1蛋白表达比较 与Control组和SAL-L组相比,SAL-H组HKF细胞JAG1和Notch-1蛋白表达显著降低(P<0.05);与SAL-H组和SAL-H+miR-NC组相比,SAL-H+miR-26a-5p mimics组HKF细胞JAG1和Notch-1蛋白表达显著降低(P<0.05);与SAL-H+NC-inhibitor组相比,SAL-H+miR-26a-5p inhibitor组HKF细胞JAG1和Notch-1蛋白表达显著升高(P<0.05)。见表7,图5。

图5 Western blot检测HKF细胞中JAG1、Notch-1蛋白表达(A Control组;B SAL-L组;C SAL-H组;D SAL-H+miR-NC组;E SAL-H+miR-26a-5p mimics组;F SAL-H+NC-inhibitor组;G SAL-H+miR-26a-5p inhibitor组)

表7 7组HKF细胞JAG1和Notch-1蛋白的表达 n=6,

2.7 双荧光素酶报告基因检测结果 预测得到的miR-26a-5p与JAG1的结合位点。与JAG1-WT和miR-NC共转染组相比,JAG1-WT和miR-26a-5p mimic共转染组的荧光素酶活性显著降低(P<0.05);与JAG1-MUT和miR-NC共转染组相比,JAG1-MUT和miR-26a-5p mimic共转染组的荧光酶活性变化无显著性差异(P>0.05)。见表8,图6。

图6 miR-26a-5p与JAG1的结合位点预测

表8 荧光素酶活性比较

3 讨论

KD是良性的真皮纤维增生性肿瘤,好发于10～30岁人群,其中约有86%患者产生瘙痒且难以有效控制,严重影响患者的生活质量和心理健康[9]。临床治疗KD主要依靠外科手术或病灶内注射类固醇药物的方法,但其容易复发,且复发后通常出现病情加重的现象,因此寻找治疗KD的新型药物与治疗方法具有重要意义[10]。HKF细胞在KD的形成、病情发展和转归中处于重要环节,因其分裂能力和增殖能力强、适应性强,易培养,可在体外稳定培养的特性,是体外研究KD药理作用和机制的常用细胞[11]。

红景天又名蔷薇红景天,多分布于我国西藏、四川与甘肃等地,种类繁多,具有益智养心、补气清肺、收敛止血等功效[12]。SAL作为红景天的有效成分之一,越来越多研究者证明其具有多种药理作用。Xu等[13]研究发现SAL可通过激活SIRT1抑制氧化应激信号通路,可能成为治疗银屑病的理想候选药物。Rong等[14]研究发现SAL通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导人胃癌AGS细胞凋亡和自噬,为胃癌治疗提供一定研究依据,并提出了新的见解。李军等[15]研究发现SAL通过调控SIRT1/NF-κB信号通路,减轻了氧葡萄糖剥夺/再恢复诱导的人神经母细胞瘤细胞损伤。本研究结果显示,与Control组相比,SAL-H组HKF细胞增殖能力(24 h)、迁移距离、侵袭细胞个数、S期细胞比例显著减少,细胞凋亡率、G0/G1期细胞比例显著增加。这些结果提示SAL可能具有改善KD的作用。

miR-26a-5p是微小RNA的一种,可以调控靶基因表达参与多种疾病的发生发展过程。叶恒等[16]研究发现miR-26a-5p可靶向下调PTEN表达,调控Wnt/β-catenin信号通路,促进成骨细胞增殖、分化和基质矿化。Li等[17]研究发现miR-26a-5p通过靶向CTGF来减轻脂多糖诱导的急性肺损伤,减轻肺部炎症和细胞凋亡。Li等[18]研究发现过表达miR-26a-5p可以抑制Wnt5a的表达,促进了细胞凋亡,抑制了胃癌中的细胞增殖和细胞侵袭。

JAG1是细胞表面配体,主要在高度保守的Notch信号通路中发挥作用。Notch信号通路在细胞生长发育、器官系统的代谢等过程中均发挥着重要作用[19]。Liu等[20]研究发现JAG1作为致癌基因在卵巢癌的进展和化疗耐药中起重要作用,敲低JAG1可以抑制GATA1诱导的Notch激活和细胞增殖。Yu等[21]研究发现肝细胞中JAG1过表达加剧了非酒精性脂肪性肝炎小鼠的纤维化,而GAG1敲除小鼠则免受纤维化的影响。本研究结果显示,与Control组相比,SAL-H组JAG1和Notch-1 mRNA和蛋白表达显著减少(P<0.05),miR-26a-5p表达显著增加;与SAL-H组和SAL-H+miR-NC组相比,SAL-H+miR-26a-5p mimics组HKF细胞相应指标变化趋势与上述相同。与SAL-H+NC-inhibitor组相比,miR-26a-5p inhibitor减弱了SAL对HKF细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用,抑制了细胞凋亡。提示过表达miR-26a-5p可能通过下调JAG1/Notch-1信号通路抑制HKF细胞增殖、迁移和侵袭,促进了细胞凋亡。

综上所述,JAG1是miR-26a-5p的靶标,SAL可能通过上调miR-26a-5p,靶向抑制JAG1/Notch-1信号轴抑制HKF细胞增殖、迁移、侵袭,促进细胞凋亡,改善KD。说明SAL可成为治疗KD的一个潜在药物,为临床治疗研究提供新的思路与方法。