基因编辑技术CRISPR-Cas9在畜禽改良领域的应用

房玮 郭佳朋 王梓桢 连洋 王溪 樊国翔

(华北理工大学，河北 唐山 063200)

引言

随着生活水平的提高，人们对畜禽肉蛋奶类的需求变得丰富多样，而畜禽品质的改良也成了科研工作者面临的重要问题之一。基因编辑技术是一种新兴的生物技术，其可以精准地修改生物体的基因组，从而实现对生物体性状的精准调控[1]。基因编辑技术的出现，为畜禽改良领域带来了新的机遇和挑战。畜禽改良是指通过人工选择、人工繁殖等手段，改良畜禽的生产性能、品质特征和抗病能力等方面的遗传性状，以提高畜禽的经济效益和社会效益[2]。基因编辑技术的应用，可以在畜禽改良中实现更加精准、高效、可控的遗传改良，为畜禽产业的发展提供新的动力和支撑。

基因编辑技术CRISPR-Cas9是利用细菌天然的免疫系统中的CRISPR-Cas系统，通过特定的引物和酶，实现对目标基因的精准切割和编辑。CRISPR-Cas9技术具有操作简便、效率高、精度高等优点，已经成为目前最为流行和广泛应用的基因编辑技术之一。在畜禽改良中，CRISPR-Cas9技术已经被广泛应用，取得了一系列重要的研究进展和应用成果[3]。

可以利用CRISPR-Cas9技术实现对畜禽的生长速度、肉质品质、抗病能力等方面的遗传改良。这些遗传改良可以提高畜禽的生产性能和品质特征，从而增强畜禽产业的竞争力和市场占有率[4]。

CRISPR/Cas9技术还可以用于畜禽的疾病防控。畜禽疾病是畜禽产业发展中的重要问题，其不仅会导致畜禽的生产性能下降，还会对人类的健康和生命安全造成威胁。可以用CRISPR-Cas9技术实现对畜禽抗病基因的精准编辑，从而提高畜禽的抗病能力和免疫力。这些抗病基因的编辑可以使畜禽更加健康、强壮，减少疾病发生的风险，从而提高畜禽产业的可持续发展能力[5]。

畜禽的基因资源是畜禽产业发展的重要基础，包含了丰富的遗传信息和生物多样性。通过CRISPR-Cas9技术，可以实现对畜禽基因资源的精准保护和利用，从而促进畜禽产业的可持续发展和生态保护[6]。

综上所述，基因编辑技术CRISPR-Cas9可以用于畜禽的遗传改良、畜禽的疾病防控、畜禽的基因保护和遗传资源的利用等目标[5，6]。因此，CRISPR/Cas9在畜禽改良方面的应用为畜禽产业的发展提供新的动力和支撑，具有广泛的前景和重要的意义。

1 基因编辑技术的原理和方法

基因编辑技术是一种通过精确修改生物体的基因序列来改变其性状的方法。目前常用的基因编辑技术包括锌指核酸酶(ZFN)、转录激活样效应核酸酶(TALEN)和CRISPR-Cas9等[7]。其中，CRISPR-Cas9技术是目前最为广泛应用的一种基因编辑技术，也是本文主要应用的基因编辑技术。

CRISPR-Cas9技术的原理是利用一种天然存在于细菌中的防御机制，即CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)系统。该系统可以识别并剪切入侵细菌的病毒基因组，从而保护细菌免受病毒感染。CRISPR系统由一系列短重复序列和间隔序列组成，其中间隔序列中包含了来自病毒基因组的片段。这些片段可以被转录成RNA，与Cas蛋白结合形成复合物，从而识别并剪切与这些片段相匹配的DNA序列[8]。利用CRISPR-Cas9技术进行基因编辑的方法主要包括以下几个步骤。

1.1 设计sgRNA

sgRNA是一种由CRISPR系统中的RNA和人工合成的RNA序列组成的复合物，用于指导Cas9蛋白识别并剪切目标DNA序列。sgRNA的设计需要考虑到目标基因的位置、长度和特异性等因素。

1.2 合成sgRNA和Cas9蛋白

sgRNA和Cas9蛋白可以通过化学合成或基因工程技术进行制备。合成后的sgRNA和Cas9蛋白可以通过转染或电穿孔等方法导入到目标细胞中。

1.3 识别和剪切目标DNA序列

sgRNA和Cas9蛋白复合物可以识别并结合到目标DNA序列上，从而引导Cas9蛋白剪切目标DNA序列。剪切后的DNA序列可以通过非同源末端连接或同源重组等方式进行修复。

1.4 验证编辑效果

编辑后的细胞可以通过PCR、测序等方法进行验证，以确定编辑效果是否达到预期。

CRISPR/Cas9技术具有高效、精准、可重复性等优点，已经被广泛应用于畜禽改良、疾病治疗、基因功能研究等领域[5]。

2 基因编辑技术在畜禽改良中的应用

基因编辑技术CRISPR/Cas9已经被广泛用于改良畜禽的性状，如提高畜禽肉的产量和品质，提高畜禽抗病性，提高畜禽生长速度，提高蛋奶品质等方面。目前已经有许多研究报道了基因编辑技术在畜禽改良中的应用，见表1。

表1 CRISPR/Cas9基因编辑技术在畜禽改良中的应用

2.1 猪

利用CRISPR-Cas9技术可以精准地编辑猪基因组中的抗病基因，提高猪对病原微生物的抵抗能力。如，Fuminori等利用CRISPR-Cas9技术编辑了猪基因组中的CD163基因，使其不再受到猪瘟病毒的感染，从而提高了猪的抗病能力[9]；肌抑素基因(MSTN)限制了猪骨骼肌的生长，利用CRISPR-Cas9技术将这种基因敲除后的猪(MSTN-KO)长出更大的骨骼肌，从而有更多的肉产量，除此之外MSTN-KO表型已在牛、山羊和绵羊中引入[10]；利用CRISPR-Cas9技术将NANOS2基因敲除后的公猪(NANOS2-KO)可以引入其它具有生殖细胞遗传优势公猪的基因，增强了这种猪的遗传潜力[11]；利用CRISPR-Cas9技术还成功敲除猪的MHC系统，这种猪的器官可捐献用于异种移植，并可用于免疫学研究[12]。

2.2 鸡、鹌鹑

CRISPR/cas9可用于将鸡细胞中chANP32A基因替换为增强禽类细胞中禽类聚合酶活性的huANP32A基因，使鸡细胞中禽流感病毒增强的聚合酶活性降低，从而提高鸡提供对禽流感的抗性。CRISPR/Cas9还可用在鸡的基因组中引入类似rig-i的抗病基因，培育得到对禽流感具有更高抗性的鸡，并且这种方法对多种禽类都适用[13]。

SCRISPR-cas9介导的鹌鹑MLPH基因敲除是将CRISPR-Cas9腺病毒载体直接注入鹌鹑胚皮，之后从鹌鹑嵌合体获得后代。经检验发现这些嵌合体后代MLPH基因有突变[14]；可以利用腺病毒CRISPR-Cas9系统介导的方法使靶向肌抑素(MSTN)基因在鹌鹑体内产生突变。与杂合突变和野生型鹌鹑相比，MSTN纯合突变型鹌鹑的体重和肌肉质量显著增加，脂肪百分比下降，心脏质量增加[15]。

2.3 牛、羊

利用CRISPR-Cas9将NRAMP1基因被插入牛的基因组时，牛对牛分枝杆菌引起的牛结核病产生了耐药性[16]。利用CRISPR-Cas9技术成功替换了牛身上的异亮氨酰tRNA合成酶基因中的一个单个突变核苷酸，使之重新变回正常的异亮氨酰tRNA合成酶[17]。

绵羊的毛色是生产过程中必不可少的性状，可以利用CRISPR-Cas9基因修饰技术，获得不同颜色的绵羊被毛，毛色物理组成的差异很大程度上是基于CRISPR-Cas9的改变、突变和复制[18]；利用CRISPR-Cas9技术，通过在绵羊组织基因的非特异性碱性磷酸酶的单点插入，成功地制作了一种罕见的人类骨骼疾病——磷酸酶缺乏症的大型动物模板[19]。这些转基因绵羊完美地复制了人类的低磷症，为长期研究低磷症的发展和研究人类骨骼[20]的其他不寻常疾病都提供了一个新的领域；利用CRISPR-Cas9方法敲除绵羊的Myostatin基因，以改善绵羊的肌肉发育和生长。经检验与野生型绵羊相比，肌生成抑制素Myostatin基因缺失型绵羊的体重更高，这说明CRISPR-Cas9是一种利用基因敲除技术生产绵羊的有效方法[21]。CRISPR干预技术可在山羊的原代成纤维细胞中有效插入FGF，GDF8基因的单等位和双等位KO基因，将这些单基因KO成纤维细胞用于SCNT过程，产生活着出生并具有FGF，GDF8双等位变化的山羊[22]。CRISPR技术还被用来分析如硬脂酰辅酶A去饱和酶1的基因在山羊乳腺上皮细胞中的作用[23]。

3 CRISPR-Cas9技术的优势及在畜禽改良领域的未来发展方向

基因编辑技术CRISPR-Cas9与传统的基因改良方法相比具有许多优势。CRISPR-Cas9可以实现精确的基因改良，避免了传统基因改良方法中的随机突变；CRISPR-Cas9可以快速地实现基因改良，缩短了基因改良的时间。但CRISPR-Cas9也存在一些局限性，如该系统会产生非常有害的脱靶效应，脱靶效应在随机位点产生不利的突变，影响基因组修饰的精度，这引起了对安全性和有效性的担忧，尤其是当畜禽被饲养用于肉和蛋生产时[24]。

总体来说，CRISPR-Cas9在畜禽改良领域的应用前景非常广阔，未来可以广泛应用于畜禽的改良。CRISPR-Cas9在提高各类畜禽产品产量和品质的同时也能提高畜禽自身抗病性等[25]；此外，CRISPR-Cas9还可以用于研究农业生物的基因功能和调控机制，为现代的大农业生产提供更多的科学依据和发展方向。