酶联免疫吸附下血清组织蛋白酶d和细胞因子对诊断非酒精性脂肪肝的临床观察

褚庆华 洪娟 郑晓颉 王茜青△

(1.同济大学附属上海市第十人民医院检验科,上海 200072;2.上海市浦东新区浦兴社区卫生服务中心检验科,上海 200129)

脂肪肝是指脂肪在肝内的沉积超量,使肝脏细胞发生脂肪样变性的一种疾病,其作为世界第二大肝病,已被公认为是隐蔽性肝硬化的一个重要诱因,并且朝年轻化趋势方向发展[1]。脂肪肝按病因分为非酒精性脂肪肝(NAFLD)和酒精性脂肪肝(AFLD),以前者较为常见。目前肝组织活检病理是此病诊断的金标准,而组织活检的有创性和取样局限限制了其临床应用[2]。组织蛋白酶家族史人溶酶体重要水解酶家族,其中组织蛋白酶D(CTSD),在细胞中发挥剪切、降解多种蛋白质和多肽的作用,并参与免疫调控进程[3]。本文探讨酶联免疫吸附下血清组织蛋白酶d(CTSD)和细胞因子对诊断非酒精性脂肪肝(NAFLD)的临床观察。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取我院及社区医院2019年10月至2022年10月收治的NAFLD患者300例。纳入标准:年龄18岁以上;脂肪肝患者诊断符合《超声医学》[3]对脂肪肝的诊断标准;患者知情同意。排除标准:肝癌,其他病毒性肝炎,遗传性肝病等疾病;存在脂肪肝之外可能会对血脂、肝功能指标表达产生影响的疾病;合并心肺肾等脏器功能及呼吸功能不全;酒精性脂肪肝;智力及精神障碍者;哺乳期、孕期者;生存时间<6个月。其中男189例,女111例,年龄32～75岁,平均年龄(53.51±2.64)岁,其中轻度154例,中度97例,重度49例;同期随机选取同期健康体检腹部B超、生化检查均正常的人群为健康对照组,共300例,其中男200例,女100例,年龄25～70岁,平均年龄(53.28±3.41)岁。两组患者一般资料比较差异有统计学意义(P>0.05)。

1.2方法 所有患者于清晨空腹抽取静脉血5 mL,置于真空无菌采血管中,以2 500 rmin-1离心10 min,分离血清后取上清置于-20℃冰柜中保存待测,标本由专人管理。监测肝功能指标,包括天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、γ谷氨酰基转移酶(GGT)。血脂指标包括总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)。采用(仪器:日立7600全自动生化仪),具体方法为:TC采用GPO-POD法、TG选择酶法;运用丙氨酸底物法检测ALT,天门冬氨酸底物法检测AST,其余肝功能指标采用速率法检测。ELISA检测试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测方法,酶标仪(450 nm检测波长滤光片,570 nm或630 nm校正波长滤光片),从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条,未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内封存于2～8℃;分别将标本或不同浓度的标准品加入相应孔中(100 μl/孔),温育后,加入生物素标记抗体和过氧化物酶标记的链霉亲和素。经过温育和洗涤结合形成的免疫复合物,去除未结合的酶,然后加入显色底物TMB。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的待测因子浓度呈正相关。最后,在450 nm处测定反应孔样品吸光度(OD)值,通过绘制标准曲线计算出CTSD浓度、肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白介素-6(IL-6)。

1.3质量控制及量化标准 在检验开始前,严格按照仪器自带的操作标准对仪器进行校准。同时,定期请计量局前来对仪器进行测定,确保测量结果的准确性。所有工作人员在上岗前均要参加培训并通过考试。严格掌握各种测定方法和测定标准,减少测定误差。血液标本的采集、离心、转运、检测等均严格按照我院生化室的要求进行。

2 结 果

2.1两组人群的实验室指标情况对比 NAFLD组血脂指标中TG、TC和肝功能指标中AST、ALT和GGT、CTSD均高于对照组,细胞因子中TNF-α、IL-6同样高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 两组人群的实验室指标情况对比

2.2不同程度NAFLD患者相关血清指标比较 随着NAFLD病情严重程度的增加,TG、TC、AST、ALT 和 GGT 、CTSD、TNF-α、IL-6均呈上升趋势,各组上述指标相比差异有意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同程度NAFLD患者相关血清指标比较

2.3各项指标诊断NAFLD的ROC曲线分析 根据ROC曲线分析显示,两项指标在NAFLD诊断中以联合预测诊断的价值最高,曲线下面积(AUC)(95%CI)为0.765(0.686～0.843);其中CSTD诊断价值稍高于IL-6,AUC(95%CI)为0.700(0.614～0.787)。二者P值均<0.05,说明CSTD与IL-6联合的诊断效能最优。见图1。

图1 各项指标诊断NAFLD的ROC曲线

3 讨 论

NAFLD是由糖脂代谢紊乱诱发的以肝细胞脂质沉积为特征的肝脏疾病[4]。NAFLD早期将对全身各系统造成影响,多种疾病与NAFLD存在发病关联,现把NAFLD的危害从代谢综合征扩展到全身多系统多疾病[5]。CTSD是一种蛋白质,在人类中由CTSD基因编码。该基因编码的是一种溶酶体天冬氨酸蛋白酶,由二硫键重链和轻链组成的蛋白质二聚体,都是由一个蛋白质前体产生[6]。组织蛋白酶D是一种天冬氨酸内切蛋白酶,普遍分布在溶酶体中,它的主要功能是降解蛋白质和激活溶酶体前室中生物活性蛋白的前体。临床已有研究证实其在胃癌、结肠癌中的应用,但在NAFLD中的应用报道极少[7]。

肿瘤坏死因子(TNF),主要由活化的单核巨噬细胞产生,能杀伤和抑制肿瘤细胞促进中性粒细胞吞噬,抗感染引起发热,诱导肝细胞急性期蛋白合成,促进细胞增殖和分化,是重要的炎症因子。IL-6是趋化因子家族的一员,是免疫细胞作用于其它细胞所产生的蛋白质,当肝脏受到不同程度的损伤,由于肝脏对细胞因子的清除能力下降,使体内细胞因子通过血液运输到机体各个部位导致IL-6升高。同时它由核巨噬细胞、血管内皮细胞等产生,可通过自分泌旁分泌作用于组织细胞刺激细胞生长,促细胞外基增生参与炎症。侧面反应了它与肝纤维化的程度相关。本文结果发现,随着NAFLD病情严重程度的增加,TG、TC、AST、ALT和GGT、CTSD、TNF-α、IL-6均呈上升趋势(P<0.05),根据ROC曲线分析显示,两项指标在NAFLD诊断中以CSTD与IL-6联合预测诊断的价值最高,分析其患者水平升高的原因主要为,当人体处于高胆固醇环境下,与胆固醇结合的溶媒体大量分泌,导致转运通路紊乱,而CTSD作为溶酶体中主要的水解酶,水平也随之升高,并定位在细胞膜附近,这就导致在肝脏发生脂肪变形时,血清CTSD水平升高[8]。

综上,血清CTSD和细胞因子联合检测可以有效提高预测诊断非酒精性脂肪肝的敏感度和特异度,临床诊断价值显著。