老年2型糖尿病患者血清外泌体中神经元特异性烯醇化酶和磷酸化tau的表达及其与继发轻度认知功能障碍的相关性

郑桃林,刘超,彭璠

(解放军联勤保障部队第921医院:1内分泌科,2干部病房,长沙 410003)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是以高血糖、胰岛素抵抗和相对胰岛素缺乏为特征的慢性代谢疾病。目前,全世界有3.66亿糖尿病患者,到2030年,这一数字将达到5.52亿[1]。有研究表明,糖尿病与认知功能多个领域的表现下降及大脑结构异常密切相关[2],长期糖尿病会导致患者认知能力下降,从而增加痴呆的发生。轻度认知功能障碍(mild cognitive impairment,MCI)[3]是介于正常老化与轻度痴呆之间的一种临床状态,是正常认知进展到痴呆的过渡期。研究发现,对于MCI及早进行治疗干预可以预防或延缓痴呆的发生[4]。因此,寻找能够预测老年T2DM继发MCI的生物标志物,并采取相应措施预防MCI的发生非常重要。

外泌体是由各种细胞释放的纳米级(直径30～120nm)膜囊泡,通过胞外作用释放到细胞外。外泌体中包含的物质会根据宿主细胞的生理状态发生显著改变,因此外泌体被认为是获得致病信息和识别生物标志物的新来源。神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)是糖酵解酶烯醇化酶的神经元形式,主要位于神经元的细胞质中,是评估神经元损伤的标志物。Tau是一种细胞内微管相关蛋白,其在脑脊液中的总水平被认为反映了正在进行的神经元死亡的程度。磷酸化tau(phosphorylated tau,P-tau)的过度磷酸化形式与痴呆疾病过程中神经原纤维缠结的形成密切相关,因此P-tau是痴呆的特异性生物标志物[5]。本研究的主要目的是检测T2DM患者血清外泌体中NSE及P-tau蛋白的表达,探讨其与继发MCI的相关性,评估其是否可以作为老年T2DM患者发生MCI的潜在预测标志物。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2019年1月至2020年12月于联勤保障部队第921医院就诊的114例老年T2DM患者为研究对象(研究组)。其中女性44例,男性70例;年龄65～78(68.5±3.2)岁;T2DM病程8～21(10.3±4.5)年。另选取同期健康体检者100名作为对照组。其中女性35例,男性65例;年龄64～76(66.8±4.2)岁。纳入标准:符合《中国2型糖尿病防治指南(2019年版)》的相关诊断标准。排除标准:(1)可能引起脑功能障碍的神经系统疾病患者,如脑卒中、帕金森病、脑肿瘤等;(2)长期服用镇静、抗抑郁药物,以及可能干扰中枢神经系统的药物;(3)长期酗酒;(4)心、脑、肺等重要器官严重疾病。患者及家属均自愿同意参加并签署知情同意书。本研究符合《赫尔辛基宣言》并经过医院伦理委员会批准。除血糖指标外,2组研究对象一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05;表1)。

表1 2组研究对象一般资料比较Table 1 Comparison of baseline data between two groups

1.2 血清源性外泌体的提取和鉴定

(1)血清提取:普通干燥管抽取各实验对象10ml静脉血,室温下放置30min。然后1600g离心10min。将上清液转移至新EP管中,在4℃下,以2×104g离心10min。将上清液移至新的EP管中,-80℃保存待分析。(2)血清源性外泌体的提取:采用ExoQuick-TC试剂盒(美国SBI公司)提取血清源性外泌体。-80℃储存的血清样本冰上解冻,4℃条件下2×104g离心15min,上清液转移至新EP管中。每400μl上清液加入ExoQuiekTC试剂100μl,颠倒EP管约20次混匀,4℃静置12h。1500g离心30min,吸出上清液。无核酸酶的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)反复均匀吹打重悬离心沉淀物,将重悬液转移至新的1.5ml EP管中。(3)血清源性外泌体的鉴定:采用透射电子显微镜观察提取的血清源性外泌体形态;Western blot 检测外泌体标志物表达(检测试剂盒购自美国NanoView Biosciences)。

1.3 血清源性外泌体中NSE和P-tau的检测

采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测研究对象血清源性外泌体中NSE及P-tau的表达。其中人NSE检测试剂盒购自上海泽叶生物科技有限公司;人P-tau检测试剂盒购自武汉菲恩生物科技有限公司。检测按照试剂盒说明书严格进行操作。

1.4 简易认知状态评价量表

简易认知状态评价量表(mini-mental state examination,MMSE)是目前临床上广泛使用的成人认知状态评估工具。该量表主要对受测试者的定向力、记忆力、注意力和计算力、回忆能力、语言能力5个方面的能力进行测量,共包括11个问题项目。总分范围0～30分,分数越高表示患者认知功能越良好。认知功能损伤评分参考:正常(27～30分);轻度受损(21～26分);中度受损(10～20分);重度受损(0～9分)。

1.5 蒙特利尔认知评估量表

蒙特利尔认知评估量表(Montreal cognitive assessment, MoCA)是一种广泛使用的认知评估工具。该量表包括交替连线测验、视结构技能(立方体)、视结构技能(钟表)、命名、记忆、注意、句子复述、词语流畅性、抽象、延迟回忆和定向这11个维度项目。评估以下7个领域的认知功能:视觉空间/执行、命名、注意力、语言、抽象、记忆延迟和定向。该量表测试的最高分数为30分,分数越高,认知能力越好。以26分为界值,<26分为伴有MCI,≥26分则认知功能正常。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 血清源性外泌体的分离与鉴定

透射电镜下观察,从血清中分离的外泌体呈类圆形囊泡状,直径大小为50～120nm。Western blot分析结果显示其表达外泌体特异性标志物CD9和CD63,表明从研究对象血清中成功分离出外泌体(图1)。

图1 血清源性外泌体的镜下形态Figure 1 Microscopic morphology of serum-derived exosomesA: exosomes under transmission electron microscopye; B: electrophoresis result. CD: cluster of differentiation; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

2.2 2组研究对象MCI发生情况

MMSE量表结果显示,研究组患者出现认知功能受损的比例高于对照组;MMSE分值明显低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。MoCA量表结果显示,研究组MoCA分值明显低于对照组(P<0.05)。研究组患者中71例发生MCI,对照组中45例发生MCI,研究组出现MCI的比例高于对照组,差异均有统计学意义(表2)。

表2 2组研究对象认知评估结果比较Table 2 Comparison of cognitive assessment results between two groups

2.3 血清外泌体中NSE和P-tau的表达

根据MoCA分数将研究组114例患者分为MCI组(n=71)和非MCI组(n=43),MCI组血清外泌体中NSE和P-tau表达水平分别为(13.27±1.61)μg/L和(17.14±2.45)pg/ml,明显高于非MCI组的(10.86±1.43)μg/L和(14.49±2.25)pg/ml(t=5.728,6.154;P<0.05)。

2.4 血清外泌体中NSE和P-tau表达水平与认知受损严重程度的相关性

相关分析显示,研究组114例老年T2DM患者血清外泌体中NSE表达水平与MMSE分值和MoCA分值存在负相关(r=-0.547,-0.562;P<0.05);血清外泌体中P-tau表达水平与MoCA分值存在负相关(r=-0.583,-0.597;P<0.05;图2)。

图2 NSE和P-tau表达水平与MMSE分值和MoCA分值的相关性分析Figure 2 Analysis of correlation of NSE and P-tau expression with MMSE score and MoCA score NSE: neuron-specific enolase; P-tau: phosphorylated tau; MMSE: mini-mental state examination; MoCA: Montreal cognitive assessment.

2.5 血清外泌体中NSE及P-tau对老年T2DM患者发生MCI的预测价值

血清外泌体中NSE表达预测老年T2DM患者发生MCI的曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.729,血清外泌体中P-tau表达预测老年T2DM患者发生MCI的AUC为0.741,而两者联合预测老年T2DM患者发生MCI的AUC为0.827,高于NSE和P-tau单个指标对老年T2DM患者发生MCI的预测价值(t=3.836,3.478;P<0.05;图3)。

图3 NSE及P-tau表达预测MCI的ROC曲线Figure 3 ROC curve of NSE and P-tau expression for predicting MCIA: NSE expression; B: P-tau expression; C: combination of NSE and P-tau expression. NSE: neuron-specific enolase; P-tau: phosphorylated tau; ROC: receiver operating characteristic; MCI: mild cognitive impairment.

3 讨 论

T2DM是一种复杂的代谢性疾病,可能对身体各器官产生重大影响。T2DM患者的MCI发病率明显高于非T2DM患者。You等[6]荟萃分析结果显示,T2DM患者中MCI的合并患病率约为45.0%。T2DM导致MCI的具体机制尚不明确,目前已知可能与T2DM相关的血管风险因素(包括高血压、血脂异常和肥胖等)有关[7,8]。较长的T2DM持续时间可能导致严重的脑大血管疾病及可能损害认知功能的临床和亚临床脑梗死[9]。此外,胰岛素信号受损也是导致MCI的重要机制[10]。还有研究报道T2DM可能加重特定灰质区域的萎缩,表明T2DM在认知损害过程中可能发挥更关键的作用[11]。本研究结果显示,研究组老年T2DM患者出现认知受损的比例高于对照组,且MMSE和MoCA分值也明显低于对照组(P<0.05)。根据MoCA量表的MCI标准,本研究中老年T2DM患者出现MCI的比例高于未患T2DM的对照组(P<0.05)。这一结果与既往研究T2DM被认为是MCI的风险因素一致。

外泌体是细胞间通信的重要媒介。有研究报道,外泌体是与神经退行性疾病相关的错误折叠蛋白细胞间传递的潜在载体,其包含的分子也是神经退行性疾病的潜在诊断生物标志物[12,13]。既往有研究报道[14],在血液中发现的外泌体中包含了反映疾病特异性脑区域内病理变化的蛋白质表达谱,表明分析循环外泌体蛋白表达可能是监测中枢神经系统发病机制的新策略。本研究我们选择分离血清外泌体作为载体来研究其包含的神经退行性疾病相关蛋白表达。本研究中,我们使用ExoQuick-TC法提取血清外泌体,最终获得的囊泡状颗粒与之前研究报道的外泌体形态和大小一致,且Western印迹分析其富集外泌体特异性标志物CD9和CD63的表达,进一步确认了这些颗粒作为外泌体的特性[15]。

糖尿病引起的脑微血管损伤可能增加神经元对缺血和缺氧的敏感性,最终导致神经元凋亡,这是糖尿病促进认知功能障碍的主要病理机制之一[16]。NSE存在于神经元和其他神经外胚层来源的细胞中。当神经细胞受损时,NSE可以从细胞中大量释放并进入血液循环,导致血液中NSE水平异常升高。因此,血清NSE可间接反映神经系统损伤程度,其水平过高与老年人认知功能下降密切相关[17]。Tau是一种微管相关蛋白,在中枢神经系统(尤其是在远端轴突)中表达丰富。如果Tau蛋白过度磷酸化,会导致轴突形态和动态运输功能的不稳定和破坏[18]。过度磷酸化的Tau蛋白聚集缠结直接导致神经退行性变和相关的认知恶化[19]。因此,P-tau也被认为是认知功能障碍相关的生物学标志物。本研究结果显示,MCI组血清外泌体中NSE和P-tau表达水平明显高于非MCI组。相关分析显示,老年T2DM患者血清外泌体中NSE和P-tau表达水平与MMSE分值和MoCA分值存在负相关。以上研究结果发现,血清外泌体中NSE和P-tau与老年T2DM患者出现认知障碍有关,即患者血清外泌体中NSE和P-tau表达浓度水平越高,其出现MCI的可能性也越大。此外,我们采用AUC这个整体性的衡量指标来研究血清外泌体中NSE和P-tau表达水平预测老年T2DM患者发生MCI的准确性。结果显示,血清外泌体中NSE和P-tau对于预测老年T2DM患者发生MCI的AUC具有较高的准确性,而联合二者检测会进一步提高其预测MCI发生的准确性。

总之,老年T2DM患者血清中外泌体富含神经元损伤和认知功能障碍相关标志物NSE和P-tau,且其表达水平较非T2DM患者显著升高。相关分析表明老年T2DM患者血清中外泌体中高水平表达的NSE和P-tau与MCI有关。通过监测患者血清外泌体中NSE和P-tau表达水平的改变将有助于预测老年T2DM患者发生MCI,这将有助于医师在临床上制定措施来进行针对性的干预。