DNA实时荧光恒温扩增法联合检测对结核性胸膜炎的早期诊断价值

赵国连 雷倩 王佩 任云霞 关靖

结核性胸膜炎是由结核分枝杆菌直接感染胸膜或结核分枝杆菌菌体成分引起胸膜发生迟发型变态反应引起,被划归为第5型肺结核,在我国结核病患者中约占6.5%～8.7%[1-2]。结核性胸膜炎的早期症状与肺结核相似,常规实验室检查方法的特异度较低,诊断难度较高。目前,结核性胸膜炎的诊断标准为胸腔积液或胸膜活检标本培养阳性,菌种鉴定为结核分枝杆菌,或胸膜活检组织符合结核病改变[3]。由于胸膜穿刺活检创伤大,胸腔积液含菌量低且培养时间长,使得结核性胸膜炎的诊断尤其是早期诊断仍然具有挑战性。近年来,分子生物学检测技术为结核性胸膜炎的快速诊断提供了新的思路[4]。据报道,恒温扩增技术检测痰液中结核分枝杆菌DNA无需温度变化,扩增效率高,反应时间短,且其反应受抑制物的影响较小[5-6],但该检测技术在结核性胸膜炎诊断中的应用还鲜有报道。笔者探索了胸腔积液DNA实时荧光恒温扩增法(简称“恒温扩增法”)对结核性胸膜炎的诊断价值,以及联合常规快速检测中的腺苷脱氨酶(adenosine deaminase,ADA)和外周血结核感染 T 细胞斑点试验(T-SPOT.TB)检测的诊断价值,以期在不增加患者经济负担的前提下加快诊断速度,以尽早开展治疗。

对象和方法

一、研究对象遴选

1.研究对象:采用回顾性研究方法,选取2020年1月至2021年12月西安市胸科医院收治的不明原因胸腔积液患者427例作为研究对象,其中,男性294例(68.9%),女性133例(31.1%),年龄范围为3～99岁,年龄中位数(四分位数)为56(34,70)岁。收集研究对象的人口学特征和实验室数据,实验室数据包括恒温扩增法、结核分枝杆菌培养、ADA、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、C反应蛋白、外周血T-SPOT.TB、胸膜组织活检等检测结果。

2.纳入和排除标准:(1)纳入标准:研究对象于入院后3 d内进行了外周血T-SPOT.TB、胸部CT扫描或胸部超声检查,并抽取胸腔积液进行恒温扩增法检测、结核分枝杆菌培养、胸腔积液常规检测及生化检测;(2)排除标准:检查结果缺失、HIV阳性、免疫抑制、非结核分枝杆菌感染患者。

3.诊断标准:(1)患者有发热、咳嗽、乏力、盗汗等症状,影像学表现为胸腔积液,或抗结核药物治疗后胸腔积液明显吸收;(2)胸腔积液结核分枝杆菌培养阳性;(3)胸腔积液结核分枝杆菌分子生物学检测阳性;(4)胸膜组织活检结核分枝杆菌阳性[7]。符合(1)且满足(2)～(4)之一者,诊断为结核性胸膜炎。其他原因引起的胸腔积液为非结核性胸膜炎,包括感染性胸腔积液和恶性胸腔积液等。

二、研究方法

(一)仪器与试剂

恒温扩增试剂购自广州迪澳生物科技有限公司,ADA、LDH、C反应蛋白检测试剂购自宁波瑞源生物科技有限公司,MPB64蛋白单克隆抗体试剂购自杭州创新生物检控技术有限公司,T-SPOT.TB试剂购自广东希格生物科技有限公司。Deaou-308C恒温荧光PCR快速检测系统购自广州迪澳生物科技有限公司,BACTEC MGIT 960系统购自美国BD公司,ADVIA 2400全自动生化分析仪购自德国西门子公司。胸膜组织全自动活检枪及配套活检针购自美国巴德公司。

(二)检测方法

1.恒温扩增法:将胸腔积液用氢氧化钠处理,按照说明书加入DNA实时荧光恒温扩增试剂,在Deaou-308C恒温荧光PCR快速检测系统中检测结核分枝杆菌DNA特异性片段(插入序列IS6110)的荧光信号。仪器捕获荧光产生的样本曲线与阈值线(阈值线设置为超过正常阴性对照扩增曲线的最高点)交点横坐标读数即为探测时间(detection time,dt;1 dt=1 min),dt<40判断为阳性,dt≥40或无结果判断为阴性。

2.结核分枝杆菌培养:将胸腔积液用氢氧化钠处理,离心后,将上清液加入BACTEC MGIT 960系统进行分枝杆菌液体培养,培养出的阳性菌株先用萋-尼抗酸杆菌染色法进行涂片镜检,再用胶体金标记的MPB64蛋白单克隆抗体试剂进行抗原检测,均为阳性的样本则为结核分枝杆菌阳性。

3.ADA和LDH检测:将胸腔积液离心后加入缓冲液和ADA过氧化物酶试剂、LDH乳酸底物试剂,在ADVIA 2400全自动生化分析仪中测定ADA和LDH活性。

4.T-SPOT.TB检测:参照说明书,将外周血经培养液处理后,使用Ficoll淋巴分离液分离出淋巴细胞,用AIM-V培养基重悬细胞,加入特异性抗原反应检测孔培养20～22 h,随后加入显色液显色,计数斑点数。

5.C反应蛋白检测:在血清中加入氯化铵缓冲液,混匀孵育1～5 min,加入抗人C反应蛋白抗体乳胶颗粒,混匀后读取吸光度值。

6.胸膜组织活检:采用超声引导下的胸膜穿刺活检术取出胸膜组织,将组织用福尔马林液固定后,从显微镜下观测组织是否有结核结节以及干酪样坏死。

三、判断标准

各检测指标中有一项阳性即判断为并联检测阳性;各诊断指标均为阳性即判断为串联阳性。成本-效果由成本与效果的比值表示(C/E),C/E越小性价比越高。本研究用各种检测方法的约登指数(敏感度+特异度-1)表示其对结核性胸膜炎和非结核性胸膜炎的识别能力[8]。使用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)评估胸腔积液ADA的最佳诊断临界值,以及各检测方法的诊断效能。

四、统计学处理

应用SPSS 26.0软件进行数据的统计学分析。计量资料非正态分布,以“中位数(四分位数)[M(Q1,Q3)]”描述,组间差异的比较采用Mann-WhitneyU检验,相关性检验采用Spearman相关性分析;计数资料以“频数和百分率(%)”描述,组间差异的比较采用χ2检验或Fisher精确概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、基本情况

427例研究对象中,279例(65.3%)确诊为结核性胸膜炎(结核性胸膜炎组),其中,胸腔积液结核分枝杆菌培养阳性者有84例(30.1%),胸腔积液恒温扩增检测阳性88例(31.5%),合并肺结核者占88.2%(246/279)。427例研究对象中有30例参与了胸膜组织活检,结核分枝杆菌阳性者占46.7%(14/30)。

148例确诊为非结核性胸膜炎(非结核性胸膜炎组),其中,肺炎旁胸腔积液者110例(74.3%),恶性胸腔积液者37例(25.0%),合并肺结核者22例(14.9%)。37例恶性胸腔积液患者最终诊断为肺腺癌13例、肺鳞癌6例、肺小细胞癌4例、乳腺癌伴胸膜转移瘤3例、胸膜间皮瘤2例、淋巴癌1例、胸椎肿瘤1例、黏液纤维肉瘤1例、胸膜腺癌1例;另有5例未最终确诊。

两组患者实验室检测结果中,恒温扩增结果、ADA水平、LDH水平、结核分枝杆菌培养结果、外周血T-SPOT.TB检测结果,以及外周血C反应蛋白水平差异均有统计学意义(表1)。ADA和LDH有明显相关性(r=0.709,P<0.001)。结核性胸膜炎患者、肺炎旁胸腔积液患者、恶性胸腔积液患者出现胸腔积液渗出液的比例分别为97.5%(272/279)、80.0%(88/110)、81.1%(30/37),差异有统计学意义(χ2=35.687,P<0.001);出现血性胸腔积液的比例分别为7.9%(22/279)、6.4%(7/110)、43.2%(16/37),差异有统计学意义(χ2=30.012,P<0.001)。

表1 各实验室检测结果在结核性胸膜炎和非结核性胸膜炎患者中的分布情况

二、胸腔积液ADA最佳诊断临界值

结核性胸膜炎组ADA水平明显高于非结核性胸膜炎组,差异有统计学意义。根据ROC曲线,两组ADA水平的最佳分界值为19.5 U/L,敏感度为74.9%,特异度为87.8%(图1)。根据最佳分界值,胸腔积液ADA水平>19.5 U/L的为ADA阳性,≤19.5 U/L为ADA阴性,结核性胸膜炎组ADA阳性者有209例(74.9%),非结核性胸膜炎组ADA阳性者有19例 (12.8%),两组差异有统计学意义(χ2=149.729,P<0.001)。

图1 胸腔积液腺苷脱氨酶水平诊断结核性胸膜炎效能的受试者工作特征曲线

三、不同检测方法的诊断价值

1.单独检测:恒温扩增法、结核分枝杆菌培养的特异度均为100%,敏感度分别为31.54%和30.11%。ADA和外周血T-SPOT.TB的敏感度较高,分别为74.91%和84.95%,特异度分别为87.16%和74.91%。ADA和外周血T-SPOT.TB的ROC曲线下面积(area under curve,AUC)分别为0.81和0.78,比恒温扩增法、结核分枝杆菌培养法高(分别为0.66和0.65)。4种检测方法对结核性胸膜炎的诊断价值见表2,ROC曲线见图2。

图2 不同方法诊断结核性胸膜炎效能的受试者工作特征曲线

表2 不同检测方案用于结核性胸膜炎检测的成本-效果比较

2.联合检测: 恒温扩增法、结核分枝杆菌培养、ADA,以及外周血T-SPOT.TB检测可以通过并联或串联的方式组成多种联合检测方案。本研究根据敏感度、特异度、临床适用性等最终选取了4种联合检测方案,分别是:(1)ADA+T-SPOT.TB检测并联;(2)ADA+T-SPOT.TB检测串联;(3)恒温扩增法+ADA+T-SPOT.TB检测并联;(4)恒温扩增法+结核分枝杆菌培养+ADA+T-SPOT.TB检测并联。其中,ADA+T-SPOT.TB串联、恒温扩增法+ADA+T-SPOT.TB检测并联、恒温扩增法+结核分枝杆菌培养+ADA+T-SPOT.TB检测并联的敏感度较高,分别为94.27%、94.98%、94.98%;ADA+T-SPOT.TB检测串联的特异度为100.00%。方案(3)和(4)的各项指标均一致。具体见图3。

图3 不同方法联合诊断结核性胸膜炎效能的受试者工作特征曲线

四、不同检测方案成本比较

4种检测方法和4种联合检测方法的成本-效果(C/E)比较,其中,单种检测方法中ADA检测的C/E最小(16.13),性价比最高。联合检测方法中ADA+T-SPOT.TB检测串联性价比最高,C/E为669.23(表2)。恒温扩增法+ADA+T-SPOT.TB并联检测有利于结核性胸膜炎早期诊断,且不会增加患者负担。

讨 论

结核性胸膜炎临床症状与肺结核不易区分,许多结核性胸膜炎继发于肺结核,通过临床特征、影像学、结核抗体等常规检查手段很难确诊结核性胸膜炎[9]。结核性胸膜炎常伴有胸腔积液,其诊断的金标准除了胸膜组织活检阳性,还包括从胸腔积液中找到结核分枝杆菌,采用如抗酸杆菌染色、结核分枝杆菌培养、分子生物学检测等方法。但是很多结核性胸膜炎患者是由少量的结核分枝杆菌及其菌体成分引起的胸膜变态反应,胸腔积液中的含菌量非常低,仅通过以上检测方法容易导致漏诊[1,10]。

传统分离培养需要约21～30 d才能获得结果,延误诊断时间。随着分子生物学的快速发展,快速检测标本中结核分枝杆菌的RNA和DNA有利于早期诊断肺结核[4,11-12]。目前,PCR-荧光探针法检测胸腔积液中结核分枝杆菌DNA(TB-DNA)和恒温扩增检测技术检测结核分枝杆菌RNA在临床已有应用,但其检测阳性率不足20%,且价格较高,临床适用性不强[10-11]。恒温扩增法检测胸腔积液中结核分枝杆菌DNA的应用少有报道。本研究发现恒温扩增法与结核分枝杆菌培养的检测阳性率相当(超过30%),且特异度均为100%,未发现假阳性,检测速度快(仅需3 h)。另外,GeneXpert MTB/RIF和胸腔积液游离核酸检测(cell-freeMycobacteriumtuberculosisDNA test,CF.TB)可明显提高结核性胸膜炎诊断的敏感度[13-16],但由于GeneXpert MTB/RIF 检测价格昂贵及CF.TB还未有成熟的商品化试剂等因素,笔者所在医院检测患者较少,难以对照,因此没有纳入研究。

除了结核性胸膜炎,炎症、恶性肿瘤、自身免疫性疾病也常伴有胸腔积液,可以使用具有一定特异性的生物标志物进行鉴别诊断。不同研究中利用胸腔积液ADA检测诊断结核性胸膜炎的界值差异较大,还未有定论[17-18]。ADA检测还会受到免疫状态、年龄、吸烟史、结核性胸膜炎发展阶段等因素的影响[19-20]。本研究初步确定了利用ADA诊断结核性胸膜炎的最佳分界值,可为后续研究提供参考。另外,虽然胸腔积液T-SPOT.TB的诊断效果明显高于外周血,较少受到肺结核伴胸腔积液的干扰[21],但是在实际临床应用中,不明原因胸腔积液的患者在初期筛查时,尤其在综合医院就诊时通常会检测外周血T-SPOT.TB,转入专科医院后为了节约费用不会再做胸腔积液T-SPOT.TB检测。因此,本研究仅收集了外周血T-SPOT.TB检测数据。经过对比分析,胸腔积液ADA和外周血T-SPOT.TB检测并联的检测敏感度较高(94.27%),串联的特异度较高(99.32%)。可见,合理利用胸腔积液ADA和外周血T-SPOT.TB联合检测的结果可以提高结核性胸膜炎的诊断效能。

本研究显示,恒温扩增法+ADA+T-SPOT.TB并联和恒温扩增法+结核分枝杆菌培养+ADA+T-SPOT.TB并联的检测效能完全一致。在实际临床应用中,可以通过胸腔积液ADA<19.5 U/L且T-SPOT.TB检测结果阴性排除结核性胸膜炎,用任意胸腔积液ADA≥19.5 U/L、T-SPOT.TB检测结果阳性、恒温扩增检测结果阳性确诊结核性胸膜炎。虽然这3项检查结果分别为生化、免疫、病原学指标,但是均为快速检测方法,有助于早期诊断和治疗。且ADA和T-SPOT.TB为结核性胸膜炎疑似患者的常规检查,并不会额外增加患者负担。

根据各检测方案的成本比较,独立检验中胸腔积液ADA检测的成本-效果比最低,方案最为经济,但其敏感度和特异度不足90%,且影响因素较多,不宜作为单独诊断方案。对于结核性胸膜炎早期诊断,使用恒温扩增法获得病原学诊断依据,同时可以联合ADA、T-SPOT.TB检测获得较高的性价比。

本研究的不足之处在于未能纳入检测效能更高的GeneXpert MTB/RIF、CF.TB等方法作为对照。另外,本研究为回顾性分析和单中心研究,结果有局限性,还需进一步验证。

综上所述,胸腔积液结核分枝杆菌DNA恒温扩增法在结核性胸膜炎的临床诊断中具有较好的临床应用价值和经济价值,与ADA、T-SPOT.TB等快速检测方案并联可以在患者就诊早期诊断结核性胸膜炎。灵活运用以上几种检测的联合方案可以获得较高的性价比,减轻患者经济负担。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献赵国连:酝酿和设计实验、采集数据、获取研究经费;雷倩:酝酿和设计实验、统计分析、起草文章;王佩和任云霞:采集、分析/解释数据、行政、技术或材料支持;关靖:酝酿和设计实验、分析/解释数据、统计分析