连翘苷对H1N1病毒株感染小鼠的作用

褚佳琪 陈 刚 王祎琳 王磊丽 宋 婕 韩虹宇 陈雨婷 周 光

流行性感冒是由流感病毒引发的急性传染性疾病,潜伏期短、传染性强,其病原体可分为甲、乙、丙3型,其中甲型病毒最为常见且危害性最强,易引发大面积暴发,诱发病毒性肺炎、急性肺损伤,严重时导致多器官衰竭,危及患者生命[1]。甲型病毒具有高随机遗传漂变的特性,疫苗注射无法有效预防,临床仅能使用M2离子通道及神经氨酸酶抑制剂用以抑制子代病毒复制,但耐药性强、不良反应较多[2]。连翘苷是中药连翘的主要活性成分,具有抗氧化、抗菌、抗癌及抗病毒等生物学活性。研究表明,连翘苷可改善由甲型流感病毒引发的小鼠急性肺损伤,表现出良好的抗病毒活性[3]。然而目前关于其对甲型流感病毒感染后免疫功能及炎性细胞因子水平的影响研究鲜有。本研究建立小鼠H1N1病毒感染模型,观察连翘苷对其免疫功能指标和炎性细胞因子的影响。

材料与方法

1.材料：BALB/c小鼠80只,SPF级,雄性,6～8周龄,体质量为20±2g,购自上海吉辉实验动物饲养有限公司,生产许可证为SCXK(沪)2017-0012,动物实验许可证号为2021-0009。H1N1鼠肺适应株FM1,购自上海巴斯德研究所,生物安全实验室鸡胚传代,-80℃保存。测定其半数致死量为10-2.58/0.05ml。

2.药物、主要试剂、仪器：连翘苷(纯度：98%,上海源叶生物科技有限公司),Toll样受体7(toll-like receptors 7,TLR7)/髓样分化因子88(myeloid differentiation factor88,MyD88)信号通路激活剂罗唑利宾(Loxoribine)、实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)试剂盒(上海百舜生物科技有限公司),肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)试剂盒(上海抚生实业有限公司),兔抗小鼠CD4、CD8、TLR7、MyD88一抗[艾比玛特医药科技(上海)有限公司]。GENios Pro酶标仪(瑞士Tecan公司),FACSCanto流式细胞仪(美国BD公司),CX23光学显微镜(日本Olympus株式会社)。

3.建模与分组：小鼠适应性饲养3天后,吸入乙醚麻醉,选取60只以2倍浓度半数致死量病毒滴液50μl滴鼻,随机数字法分为感染组、连翘苷组、连翘苷+Loxoribine组,各20只;另取20只健康小鼠滴鼻等体积0.9%氯化钠溶液,设为正常组[4]。

4.干预方式：滴鼻4h后,连翘苷+Loxoribine组大鼠灌胃连翘苷(200mg/kg溶于0.9%氯化钠溶液),1h后腹腔注射Loxoribine(1毫克/只溶于PBS溶液);连翘苷组大鼠灌胃连翘苷(200mg/kg溶于0.9%氯化钠溶液),1h后腹腔注射等量PBS;正常组、感染组大鼠灌胃等体积0.9%氯化钠溶液,1h腹腔注射等量PBS。每日1次,干预14天[5,6]。

5.组织取材：前期预实验显示小鼠第8天开始出现死亡,故干预第7天每组随机选取10只小鼠,称取体质量,称重后腹腔戊巴比妥钠深度麻醉,抽取腹主动脉血,抗凝后4℃冷藏;采血后脊椎脱臼处死大鼠,冰上开胸取其全肺,称取湿重,计算肺指数(%)=肺湿重/体质量×100%;切取同位置肺组织,投入4%多聚甲醛中固定24h,脱水、包埋、浸蜡,切为4μm切片用于病理学观察;剩余肺组织分成3份,投入液氮中冷冻保存,分别用于炎性细胞因子、病毒载量及蛋白检测。末次干预结束后,统计各组剩余大鼠存活天数(末次干预后未死亡记录为14天)及死亡数,计算死亡率。

6.肺组织炎性细胞因子检测：取冷冻保存的肺组织,研磨、匀浆,低温8500r/min离心10min(离心半径8cm)取上清,ELISA法检测肺组织中TNF-α、IL-6含量,根据试剂盒说明书设计操作步骤,波长570nm经酶标仪测定吸光度(A)值,坐标纸画出标准曲线得出浓度。

7.流式细胞仪检测外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞占比：取腹主动脉采集外周血,加入兔抗小鼠CD4、CD8一抗,避光20min,低温离心3500r/min离心10min(离心半径8cm),吸弃上清,经PBS洗涤、多聚甲醛定容、细胞滤网(300目)过滤,经流式细胞仪测定CD4+、CD8+T淋巴细胞构成比,计算CD4+/CD8+。

8.qRT-PCR检测肺组织病毒相对表达量：取冷冻保存的肺组织,低温研钵充分研磨,加入PBS匀浆,经Trizol法提取总RNA,反转录为cDNA,根据试剂盒说明书设置反应体系：Sybr Green染料10μl,上下游引物(10μmol/L)各0.5μl,Mix 1μl,dd H2O补充至20μl;反应条件：50℃ 2min,95℃ 8min,95℃ 20s,62℃ 30s,72℃ 1min,进行40个循环,得出最终CT值,以GAPDH为内参基因,2-△△CT法分析计算病毒基因相对表达量。实验所用引物：FM1：上游引物：5′-GAGTCTTCTAACCGAGGTCG-3′;下游引物：5′-GCACAGAGACTTGAAGATGT-3′;GAPDH：上游引物：5′-TGAAATGTGCACGCACCAAG-3′;下游引物：5′-GGGAAGCAGCATTCAGGTCT-3′。重复3次取均值。

9.HE染色观察肺组织病理变化：取肺组织切片,常规HE染色,显微镜下观察肺组织病理变改变,并拍照记录。

10.Western blot法检测肺组织TLR7、MyD88蛋白表达量：取冷冻保存的肺组织,研磨、匀浆,加入RIPA裂解液,低温离心10000r/min离心10min(离心半径15cm)取上清并定量。取少量样本蛋白,混合4倍量上样缓冲液,水浴加热,电泳分离,湿转至膜,5%脱脂牛奶封闭1h,加入稀释(1∶500)兔抗小鼠TLR7、MyD88一抗,冰箱冷藏过夜,TBST液清洗,加入稀释(1∶2000)二抗,常温下孵育2h,TBST液清洗,化学发光液发光、暗盒显影,以GAPDH为内参蛋白,成像分析仪扫描并分析TLR7、MyD88相对蛋白表达量。

结 果

1.存活天数及死亡率：与感染组比较,连翘苷组存活天数增加,死亡率降低(P<0.05);与连翘苷组比较,连翘苷+Loxoribine组存活天数减少,死亡率升高(P<0.05),详见表1。

表1 各组小鼠存活天数及死亡率比较

2.肺指数：与正常组比较,感染组肺指数升高(P<0.05);与感染组比较,连翘苷组肺指数降低(P<0.05);与连翘苷组比较,连翘苷+Loxoribine组肺指数升高(P<0.05),详见表2。

表2 各组小鼠肺指数比较

3.肺组织炎性细胞因子TNF-α、IL-6：与正常组比较,感染组肺组织TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05);与感染组比较,连翘苷组肺组织TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05);与连翘苷组比较,连翘苷+Loxoribine组肺组织TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05),详见表3。

表3 各组小鼠肺组织炎性细胞因子TNF-α、IL-6水平比较

4.外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞占比：与正常组比较,感染组外周血CD4+T淋巴细胞占比、CD4+/CD8+降低,CD8+T淋巴细胞占比升高(P<0.05);与感染组比较,连翘苷组外周血CD4+T淋巴细胞占比、CD4+/CD8+升高,CD8+T淋巴细胞占比降低(P<0.05);与连翘苷组比较,连翘苷+Loxoribine组外周血CD4+T淋巴细胞占比、CD4+/CD8+降低,CD8+T淋巴细胞占比升高(P<0.05),详见表4。

表4 各组小鼠外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞占比比较

5.肺组织病毒表达量：与感染组比较,连翘苷组肺组织病毒相对表达量降低(P<0.05);与连翘苷组比较,连翘苷+Loxoribine组肺组织病毒相对表达量升高(P<0.05),详见表5。

表5 各组小鼠肺组织病毒相对表达量比较

6.肺组织病理变化：HE染色结果显示,正常组小鼠肺组织结构完整,肺泡状态正常;感染组小鼠肺组织结构受损严重,肺泡壁断裂变形,组织间隙肿胀,毛细血管扩张充血,可见大量炎性细胞浸润;连翘苷组、连翘苷+Loxoribine组小鼠肺泡壁恢复连接,组织机构成形,炎性细胞浸润减少,间隙肿胀程度变小,连翘苷组病理改善更为显著,详见图1。

图1 肺组织病理变化(HE染色,×200)A.正常组;B.感染组;C.连翘苷组;D.连翘苷+Loxoribine组

7.肺组织TLR7、MyD88蛋白表达量：与正常组比较,感染组肺组织TLR7、MyD88蛋白表达量升高(P<0.05);与感染组比较,连翘苷组肺组织TLR7、MyD88蛋白表达量降低(P<0.05);与连翘苷组比较,连翘苷+Loxoribine组肺组织TLR7、MyD88蛋白表达量升高(P<0.05),详见表6、图2。

图2 肺组织TLR7、MyD88蛋白表达A.正常组;B.感染组;C.连翘苷组;D.连翘苷+Loxoribine组

表6 各组小鼠肺组织TLR7、MyD88蛋白表达量比较

讨 论

甲型流感是一种高暴发性呼吸道急症,主要通过飞沫传播,近年来全球年均发病人数超百万,已成为人际传播主要毒株之一[7,8]。病毒可侵肺诱发支气管及细支气管周围间质充血,导致肺泡腔内渗出炎性液体,形成透明膜附着于肺泡表面,球形病毒包涵体大量出现,并扩散至肺部[9,10]。病毒大量复制导致固有免疫受损,免疫T细胞不能有效应答,机体抗病毒能力降低,特异性免疫被激活,在其作用下合成并释放大量促炎性细胞因子,诱发免疫炎性损伤,加剧肺组织水肿及肺泡出血[11,12]。因此,修复固有免疫,抑制炎性反应是治疗甲型流感的关键。

中医治疗病毒性疾病由来已久,具有多靶点、多效应及低不良反应等多种优势[13]。连翘是中医防瘟要药,取自木犀科植物连翘干燥果实,可治清热散结、消肿解毒,连翘苷是自连翘中提取的木脂素类单体,具有良好的抗病毒活性,是常用中成药连花清瘟胶囊、双黄连的主要有效成分之一[14,15]。本研究结果显示,与感染组比较,连翘苷组存活天数增加,死亡率、肺指数、肺组织TNF-α和IL-6水平、外周血CD8+T淋巴细胞占比、肺组织病毒相对表达量降低,外周血CD4+T淋巴细胞占比、CD4+/CD8+升高,提示连翘苷可抑制病毒复制,改善肺功能及免疫功能,降低炎性细胞因子水平,从而治疗H1N1感染。

TLR是机体重要的固有免疫识别受体,TLR7是其常见亚型,广泛分布于多种免疫细胞内,可识别流感病毒RNA,激活下游转接蛋白分子MyD88,诱导促炎性细胞因子NF-κB活化并转移至胞核,促进炎性细胞因子大量合成及释放,形成级联反应,加剧免疫炎性损伤[16～18]。Wang等[19]研究认为,抑制TLR7/MyD88信号通路可显著抑制炎性细胞因子表达,减轻甲型流感病毒感染,提示TLR7有望成为甲型流感治疗新靶点。本研究结果显示,与正常组比较,感染组肺组织TLR7、MyD88蛋白表达量升高,经连翘苷干预后均降低,提示H1N1病毒感染后TLR7/MyD88通路异常激活,而连翘苷可能通过抑制TLR7/MyD88信号通路活性来发挥抗病毒疗效。

综上所述,连翘苷可抑制H1N1病毒复制,改善肺功能及免疫功能,可能通过抑制TLR7/MyD88信号通路活性降低炎性细胞因子水平,从而保护H1N1感染小鼠。今后将增加转录组的相关实验作为研究方向,进一步探究连翘苷抗H1N1病毒感染株的可能机制。