miR-218-5p、HMGB1在过敏性紫癜患儿外周血中的表达及临床意义

于少飞 张佳美 周凌浩 曹丽美 柴少卿 冯万禹 李兆涵

过敏性紫癜(Henoch-Schönlein purpura,HSP)是儿童期常见与自身免疫相关的疾病,儿童中发生率为135/100万[1]。HSP的发病机制尚不明确,普遍认为机体免疫功能失衡以及大量炎性细胞因子表达失衡在HSP、紫癜性肾炎(Henoch-Schönlein purpura nephritis,HSPN)发病机制中发挥作用。而且肾脏受损的严重程度是决定患儿预后的关键因素[2]。高迁移率族蛋白1(high-mobility group box-1,HMGB1)是核DNA结合蛋白,一种促进炎症发生、发展的细胞因子,在体内参与多种炎症相关性疾病和自身免疫性疾病的发生、发展。Chen等[3]研究发现HMGB1在HSP患儿血清中表达明显升高,在HSPN患儿血清中表达升高更为显著,促进细胞产生和释放多种炎性细胞因子,使内皮细胞受损。另有研究证实HMGB1是miR-218-5p的直接靶标[4,5]。miRNA是不能翻译为蛋白质的RNA,在胞质中发育成熟且具有生物学活性。研究发现,miRNA在免疫性疾病中占据着重要地位[6]。国内研究者对45例HSP儿童和27例健康对照组儿童进行microRNA微阵列分析,发现miR-1-3p、miR-19b-1-5p和miR-29b-1-5p上调,而miR-483-5p和miR-1246下调。本研究旨在对HSP、HSPN患儿外周血中miR-218-5p和HMGB1进行定量检测,并与临床实验室指标进行分析,探讨miR-218-5p及HMGB1在HSP患儿发病机制中发挥的作用。

材料与方法

1.研究对象：本实验随机选取2019年11月～2020年8月于内蒙古自治区人民医院儿科住院诊治的HSP及HSPN患儿各30例作为实验组,HSP组患儿男性17例,女性13例,平均年龄为5.93±3.70岁,HSPN组患儿男性14例,女性16例,平均年龄为5.87±2.93岁。选取同期于笔者医院儿科门诊体检健康儿童30例作为对照组,男性16例,女性14例,平均年龄为6.67±3.56岁。本研究通过笔者医院医学伦理学委员会审批(伦理学审批号：202206002L)。

2.检测指标及方法：取上述3组儿童(HSP、HSPN均在起病急性期,入院24h内)外周静脉血4ml分装于EDTA抗凝管中,使用离心机3500r/min予以离心10min,取上清液血清置于-80℃冰箱保存,一管用于RT-PCR检测miR-218-5p水平,取出-80℃冰箱储存血清样本,室温下融化,取出试剂盒,按照试剂盒说明书进行RNA提取。然后取5μl RNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳,以检测miRNA的完整性。用First Strand cDNA Synthesis Kit(with gDNA Eraser),Genenode Biotech LTD (编号：4203)进行反转录,实验操作按产品说明书进行。用FS384 real-time PCR system型荧光定量PCR仪,采用 RQ/2-△△CT法进行数据的相对定量分析。另一管用于ELISA法检测HMGB1水平,从准备试剂开始按照实验步骤逐步进行,最后绘制HMGB1标准曲线,并根据曲线方程式计算各个样品的浓度值。同时收集HSP组、HSPN组儿童的实验室指标,包括血白细胞计数(white blood cell,WBC)、中性粒细胞绝对计数(absolute neutrophil count,ANC)、淋巴细胞绝对计数(absolute lymphocyte count,ALC)、红细胞计数(red blood cell,RBC)、血小板计数(platelet,PLT)、尿素(urea,UREA)、肌酐(creatinine,CRE)、尿酸(uric acid,UA)。

结 果

1.一般资料比较：3组间儿童的年龄、性别比较,差异均无统计学意义(P均>0.05,表1),3组基线资料数据具有可比性。

2.miR-218-5p、HMGB1的表达水平：3组间miR-218-5p和HMGB1比较,差异有统计学意义(P<0.05),且组间两两比较结果显示,miR-218-5p为对照组显著高于HSP组和HSPN组,HMGB1为HSPN组显著高于HSP组和对照组(表2、图1、图2)。过敏性紫癜患儿的miR-218-5p和HMGB1呈显著负相关(r<0,P<0.05,图3)。

图1 miR-218-5p在3组间表达比较

图2 HMGB1在3组间表达比较

图3 miR-218-5p与HMGB1表达相关性分析

表2 3组间miR-218-5p和HMGB1比较

3.HSP组、HSPN组儿童外周血miR-218-5p、HMGB1表达水平、临床实验室指标表达水平、肾脏损伤发生的相关性分析：HSP组、HSPN组两组间各实验室指标比较,WBC、ANC、miR-218-5p、HMGB1差异有统计学意义(P<0.05),且HSPN组的WBC、ANC、HMGB1均显著高于HSP组,而miR-218-5p指标显著低于HSP组。HSP组与HSPN组比较,ALC、RBC、PLT、尿素、肌酐、血尿酸指标比较,差异均无统计学意义(P均>0.05,表3)。

表3 HSP、HSPN两组间患儿各实验室指标比较

4.HSP患儿发生肾损伤相关指标的二元Logistic回归分析：为了进一步检验单因素有差异的4个观察指标与是否发生肾损伤的相关性,寻找它们之间的关系,选择二元Logistic回归模型,将是否发生肾损伤作为因变量,将WBC、ANC、miR-218-5p、HMGB1共4个观察指标作为自变量,把所有数据进行标准化后做二元Logistic回归,详见表4。结果显示,miR-218-5p、HMGB1共两个指标与发生肾损伤之间存在显著相关关系(P<0.05),而且miR-218-5p是影响发生肾损伤的独立保护因素(OR<1),HMGB1是影响发生肾损伤的独立危险因素(OR>1)。而WBC、ANC共2个指标均不是影响发生肾损伤的独立影响因素(P均>0.05)。

表4 是否发生肾损伤的二元Logistic回归分析

5.miR-218-5p、HMGB1预测肾脏损伤的ROC曲线：为得到miR-218-5p、HMGB1共2个指标对于是否发生肾损伤的诊断价值,选择ROC曲线分析,详见图4。得出miR-218-5p指标曲线下面积0.930,95% CI：0.867～0.994,说明miR-218-5p指标诊断疾病效果较好。miR-218-5p诊断疾病的敏感度为76.7%,特异性为100.0%,对应的截断值为0.515。HMGB1指标曲线下面积0.929,95%CI：0.856～1.000,说明HMGB1指标诊断疾病效果较好。诊断指数=敏感度-(1-特异性),选择诊断指数最大值为诊断截点,当敏感度为86.7%,特异性为90.0%时诊断指数最大为0.767,诊断效能较好,对应的截断值为3348.200。

图4 miR-218-5p、HMGB1预测肾损伤的ROC曲线

讨 论

HSP是一种常见于儿童的白细胞碎裂性小血管炎症性疾病,大多数HSP病例预后良好,但肾脏受累是决定发生率和病死率的最重要预后因素[7]。HSPN患儿严重者可表现为肾衰竭和高血压。一项数据显示,HSP的复发率是16.4%,而且这种复发与肾脏受损伤是密切相关的[8]。可见HSPN在疾病中占据重要的地位,目前诊断HSPN缺乏特异性生物学标志物,金标准为肾穿刺活组织病理检查,为有创性检查,患儿及家属不易接受。为了减少疾病产生的家庭负担和更好的诊断治疗HSP病例,近年来研究者致力于探索HSP、HSPN发病机制的研究。

HMGB1在HSP发病机制中起促炎作用,研究还通过建立小鼠模型发现,HMGB1阻断剂明显减轻血管炎,改善炎性细胞浸润[9]。HMGB1是一种在细胞中普遍存在的核蛋白,它几乎存在于所有类型的细胞中。除在细胞内发挥作用外,还可被激活的炎性细胞、坏死的细胞、被巨噬细胞吞噬的凋亡细胞以及直接通过胞吐等方式释放到细胞外发挥生物学作用,介导免疫反应的激活如炎症趋化和细胞因子释放[10]。上述功能也在疾病中得到证实,如急性肾损伤患者肾小管上皮细胞的凋亡增加和炎性反应的发生与HMGB1介导的炎性细胞因子的释放,如IL-6和TNF-α,具有明确相关性[11]。另外,在HSP及HSPN中,HMGB1可以通过诱导NF-κB的核转位,使IL-6及TNF-α表达升高,血管内皮细胞的炎性反应加重[3]。本实验为进一步探讨HSP、HSPN发病机制,通过双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验检测到HMGB1在HSP患儿中表达增加,尤其在HSPN患儿中表达更为显著,差异有统计学意义(P<0.05)。为进一步明确HMGB1的上游调控机制,结合以往研究结果,本实验论证在HSP、HSPN患儿外周血中HMGB1的调控机制。

miR-218-5p是miRNA家族成员之一,miRNA可以在机体内对细胞的生长发育进行调节,对维持机体的稳态产生重要作用。近年来,研究发现在内皮细胞中表达的miR-218有助于肾脏脉管系统的发育和修复[12]。另有实验通过双荧光素酶报告基因分析证明miR-218-5p可以靶向调控HMGB1表达,在加入miR-218-5p 模拟物组双荧光素酶活性明显低于miR-218-5p 抑制剂组,并用Pearson分析显示miR-218-5p与HMGB1呈明显负相关[13]。体外实验证明在HSP模型中血管损伤处miR-218-5p表达明显下降,HMGB1表达明显升高,通过实验证明二者之间呈明显的负相关,而且miR-218-5p靶向调控HMGB1的表达,参与HSP发生、发展。miR-218-5p在HSP患儿外周血中表达的相关报道较少。

本实验通过RT-PCR法检测miR-218-5p在HSP、HSPN患儿中的表达,发现miR-218-5p在HSP患儿外周血中表达降低,在HSPN患儿表达中下降更为明显,差异有统计学意义,用Pearson相关分析miR-218-5p表达与HMGB1表达的相关性,显示二者呈负相关。在HSP、HSPN患儿中,推测miR-218-5p可能通过靶向调控HMGB1的表达,影响下游炎性细胞因子的表达来发挥生物学作用。本研究又分析了miR-218-5p、HMGB1与临床指标之间预测肾损伤的可能性,得出HSP患儿是否发生肾损伤与miR-218-5p、HMGB1、WBC、ANC相关,但与ALC、RBC、尿素、肌酐、血尿酸之间无显著相关性。一项Meta分析数据证实中性粒细胞与淋巴细胞比值可作为预测HSP患者肾损伤发生的有效生物学标志物[14]。本研究中同样观察到ANC与肾损伤发生存在相关性,还发现肾损伤与尿素、肌酐、血尿酸之间无明确相关性,可能与研究样本量小以及选择血液学检测指标作为预测肾损伤的发生相关。本实验通过Logistic回归分析显示,miR-218-5p是HSPN发生的独立保护性因素,HMGB1是HSPN发生的独立危险因素。

综上所述,本研究对HSP、HSPN患儿体内miR-218-5p、HMGB1的表达进行探讨,并与临床实验室指标进行综合分析,得出miR-218-p可能为HSPN发生的独立保护性因素,HMGB1可能是HSPN发生的独立危险因素。miR-218-5p、HMGB1可能为HSP患儿肾脏损伤发生的生物学标志物,为临床诊断、治疗提供新靶点。