木犀草素通过抑制IL-6/STAT3信号通路抑制结肠癌细胞生长

符方芳 姜靖雯 陈霭莹 黄闻柏

随着医学技术和研究的进步,Ⅰ、Ⅱ期结肠癌患者的预后有了显著改善,但病死率仍居高不下,研究结肠癌的病理机制仍然是科学研究的重点[1～3]。中医药治疗各种疾病有着悠久的历史渊源,显现出相对较少的毒性不良反应,且明显提高患者的生活质量[4～6]。如苦参的抗炎作用和六味地黄丸的抗氧化作用[7,8]。在中药应用的化合物中,木犀草素是一种天然黄酮类化合物,被广泛用于抗炎、抗氧化、降尿酸和抗肿瘤等[9]。此外,Ambasta等[10]的一项研究报告提示,木犀草素可以通过调节多种信号级联来治疗结肠癌。然而,木犀草素治疗结肠癌机制仍不清楚。

人单核细胞白血病细胞(Tohoku hospital pediatrics-1,THP-1)已被广泛用于研究单核-吞噬细胞的功能、信号通路、营养和药物转运,佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(phorbol myristate acetate,PMA)用于诱导巨噬细胞活化以建立免疫调节研究的体外模型[11]。脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激使THP-1巨噬细胞极化为M1型,并释放细胞因子,如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α和白细胞介素(interleukin,IL) -6,可作为炎症模型来研究各种药物的抗炎作用[12,13]。IL-6/信号转导及转录激活因子3(STAT3)是一条重要的信号通路,可调节多种癌症如结直肠癌和乳腺癌的进展,是癌症免疫治疗的重点研究靶点[14,15]。此外,有研究表明,炎性肿瘤微环境可促进IL-6/STAT3信号通路的活化,致癌细胞转移[16,17]。木犀草素是否抑制IL-6/STAT3活化及其机制尚不明确。本研究通过巨噬细胞M1型极化诱导结肠癌细胞生长,探讨木犀草素治疗结肠癌的潜力及其药理和分子机制,为木犀草素治疗结肠癌提供理论依据。

材料与方法

1.细胞培养、THP-1极化、Transwell实验：人结肠癌细胞株(SW480和SW620)购自美国ATCC细胞库,Leibovitz′s L-15培养基、RPMI1640培养基、10%胎牛血清、Trizol试剂购自美国Invitrogen公司,THP-1 购自中国普诺赛公司,DEPC水购自美国Thermo Fisher Scientific公司,PrimeScript RT kit、SYBR®Premix Ex TaqTM Ⅱ kit购自日本TaKaRa Bio公司。人结肠癌细胞株(SW480和SW620)培养于Leibovitz′s L-15培养基,THP-1培养于RPMI-1640培养基,添加10%胎牛血清,37℃、5%CO2培养箱孵育。为诱导巨噬细胞向M1型极化,在Transwell小室下室加入320nmol/L PMA孵育12h,然后1μg/ml LPS诱导巨噬细胞极化。将SW480和SW620细胞(1×105个)接种于Transwell小室的上室,分别并与IL-6 (50ng/ml)共孵育及抗IL-6抗体(20ng/ml)作用24h。在下室培养基中加入10% FBS后孵育24h。接着用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次,并用无水乙醇固定30min,最后用0.1%结晶紫染色。使用光学显微镜(Olympus,×200)对SW480和SW620细胞进行计数。

2.反转录定量聚合酶链反应(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测：SW480和SW620细胞加入Trizol试剂,13000×g(4℃,10min)离心后,取10μl DEPC水添加到沉淀中,使用PrimeScript RT kit提取RNA。使用SYBR®Premix Ex TaqTM Ⅱ kit合成 cDNA,qPCR使用 Applied Biosystems®7500 real-time PCR system进行。反应条件：95℃ 10min,55℃ 2min,72℃ 2min,后95℃ 15s,60℃ 32s,40个循环。所用引物序列详见表1。以GAPDH为内参,采用2-ΔΔCt方法计算。

表1 RT-qPCR引物序列

3.酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)：收集SW480和SW620细胞上清液,根据试剂盒说明书使用IL-6 Quantikine ELISA试剂盒测定IL-6含量。

4.Western blot法：提取SW480和SW620细胞蛋白,使并采用BCA 法测定蛋白浓度,具体操作参照蛋白提取试剂盒,蛋白样品置于-80℃保存备用。取 50μg 蛋白样品进行 SDS-PAGE 电泳,湿转法转膜,5% 脱脂奶粉室封闭,分别添加一抗 anti-STAT3 (1∶1000)、anti- (p)-STAT3 (1∶2000)。4℃孵育过夜TBST缓冲液洗膜 3 次,添加二抗GAPDH抗体(1∶5000)室温孵育1h,洗膜,显色,曝片,观察并分析结果。

5.细胞增殖实验：将细胞计数试剂盒-8(CCK-8)试剂加入96孔板(含SW480和SW620;4×103个/孔)。在20℃的黑暗条件下孵育60min后,用酶标仪在490nm处测定吸光度。

结 果

1.木犀草素对M1型极化的影响：RT-qPCR和ELISA结果显示,与未用LPS处理的对照巨噬细胞比较,M1型巨噬细胞极化后IL-6表达增加。不同浓度木犀草素(0、10、30和60μmol/L)处理后,IL-6 mRNA和蛋白水平的表达逐渐降低。在30或60μmol/L木犀草素处理下,IL-6的表达比较,差异无统计学意义(图1)。因此选择30μmol/L木犀草素作为后续实验的处理剂量。

图1 木犀草素和M1型极化对IL-6表达的影响与巨噬细胞组比较,*P<0.05;与LPS组比较,#P<0.05

2.木犀草素抑制M1型巨噬细胞对SW620和SW480细胞的作用：为了探究M1型巨噬细胞对结肠癌细胞的影响,将其与SW620和SW480细胞共培养24h。ELISA结果显示,与正常细胞比较,M1型巨噬细胞促进结肠癌细胞分泌IL -6,木犀草素抑制M1型极化(图2)。CCK-8和Transwell实验结果显示,与正常细胞比较,细胞增殖、迁移、M1型巨噬细胞诱导的侵袭被木犀草素抑制(图3、图4)。Western blot法结果显示,M1型极化促进STAT3的磷酸化,而木犀草素抑制M1型极化(图5)。因此,木犀草素有效抑制了其表达IL-6介导的M1型极化、STAT3通路的激活和SW620和SW480细胞的生长。

图2 ELISA检测木犀草素和M1型极化对SW480、SW620细胞IL-6蛋白分泌的影响

图3 CCK-8法检测木犀草素和M1型极化对SW480、SW620细胞增殖率的影响

图4 Transwell检测木犀草素和M1型极化对SW480和SW620细胞迁移和侵袭能力的影响

图5 Western blot法检测木犀草素和M1型极化对STAT3磷酸化水平的影响

3.抗IL-6抗体和IL-6对SW620、SW480细胞的作用：为了证实IL-6/STAT3信号通路在M1型极化中的作用,分别用IL-6和抗IL-6抗体孵育SW620和SW480细胞。结果表明,IL-6的加入促进了细胞的增殖、迁移和侵袭,并激活了IL-6/STAT3信号通路;抗IL-6抗体对细胞功能或IL-6/STAT3信号通路无明显影响 (图6～图8)。

图8 Western blot法检测IL-6和抗IL-6抗体对STAT3磷酸化水平的影响

4.抗IL-6抗体可逆转IL-6对M1型极化的影响：在SW620细胞、SW480细胞(与M1型巨噬细胞共同培养)中加入IL-6和抗IL-6抗体。结果表明,IL-6通过促进M1型极化及激活激活IL-6/STAT3信号通路促进结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭,而抗IL-6抗体部分抑制M1型极化对结肠癌细胞的作用(图9～图11)。

图9 CCK-8法检测IL-6/抗IL-6抗体对M1型极化SW480和SW620细胞增殖率的影响

图11 Western blot法检测IL-6/抗IL-6抗体对M1型极化诱导的STAT3磷酸化水平的影响

5.与木犀草素类似,抗IL-6抗体逆转IL-6对M1型极化的影响：在SW620细胞、SW480细胞(与经木犀草素处理的M1型巨噬细胞共培养)中加入IL-6和抗IL-6抗体。结果表明木犀草素通过抑制STAT3磷酸化抑制M1型极化,抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭。IL-6的加入逆转了木犀草素的作用,而抗IL-6抗体部分抑制了M1型极化,促进了木犀草素的治疗作用(图12～图14)。

图12 CCK-8法检测IL-6、抗IL-6抗体对木犀草素处理的SW480和SW620细胞增殖率的影响

图14 Western blot法检测IL-6、抗IL-6抗体对木犀草素处理的STAT3磷酸化水平的影响

讨 论

中医循证研究的重要意义在于确定疾病的治疗策略,如高血糖和动脉粥样硬化等[18～21]。已有证据表明,木犀草素通过诱导凋亡癌细胞在结肠癌细胞中发挥抗癌作用[22,23]。然而,M1型巨噬细胞极化与木犀草素作用之间的相关性仍然未知。本研究通过PMA诱导THP-1细胞建立了M1型极化模型,探讨木犀草素在免疫治疗方面对结肠癌细胞的作用及机制。研究结果表明,LPS通过诱导SW480细胞和SW620细胞表达和分泌IL-6,促进巨噬细胞向M1型极化,创造炎症环境。木犀草素的抗炎特性阻止了M1型巨噬细胞的作用,表明木犀草素通过抑制M1型极化抑制IL-6的产生。这一结果与Chen等[24]的研究结果一致。

细胞免疫代谢可能是调节巨噬细胞极化的重要因素[25]。也有报道M1型极化的巨噬细胞通过产生炎性细胞因子Il-6促进炎性反应[26]。炎症肿瘤微环境中存在的免疫细胞可能是促进癌症发展的关键[27]。因此,抑制巨噬细胞极化为M1型可能是预防结肠癌发生、发展的关键。本研究中,30μmol/L的木犀草素抑制M1型极化,减少IL-6的表达和分泌,并抑制SW620细胞和SW480细胞增殖、迁移和侵袭。此外,木犀草素抑制M1型极化诱导的IL-6/STAT3信号通路的激活。这些结果证实了木犀草素可以通过减轻炎症环境来抑制结肠癌细胞的生长和迁移。笔者还观察到所有实验条件下,抗IL-6抗体可抑制IL-6的产生和分泌以及M1型极化。因此,木犀草素对炎症环境的影响可能是通过IL-6/STAT3通路实现的,木犀草素可能是一种很有前景的防治IL-6介导的炎症的药物。

本研究存在的局限性：①没有证实木犀草素在动物模型中的作用;②与长链非编码RNA-microRNA-mRNA信号通路相互连接的几个网络可能在结肠癌的治疗中发挥显著的作用,本研究未对此开展实验。未来研究应重点关注这些研究方向。

综上所述,木犀草素通过作用于IL-6/STAT3信号通路抑制M1型极化,从而抑制结肠癌细胞的生长、迁移和侵袭,为结肠癌的治疗提供了新的参考证据。