TLR4/NF-κB信号通路在肾缺血再灌注损伤中的作用机制

李 强 靳书滨 霍韶军

肾缺血再灌注(renal ischemia-reperfusion,RIR)损伤常继发于肾脏外科手术及术后恢复过程,是引发急性肾衰竭的高危因素[1]。RIR损伤病理机制复杂,炎性反应在其进展过程中具有重要作用[2,3]。Toll样受体4/核因子-κB(Toll-like receptor 4/nuclear factor-κB,TLR4/NF-κB)是机体炎性反应的关键信号通路,有研究发现,TLR4/NF-κB信号通路在大脑、心肌、小肠缺血再灌注损伤过程中发挥着重要作用[4～6]。本研究旨在探讨TLR4/NF-κB信号通路在RIR损伤中的作用及其机制,以期为RIR损伤防治探索新的作用靶点。

材料与方法

1.材料：(1)实验动物：SPF级雄性SD大鼠96只(7周龄,220±20g),购自河北伊维沃生物科技有限公司[SCXK(冀)2020-002],清洁环境饲养：室温25℃、相对湿度55%～65%,光照黑暗各12h交替。(2)药物与试剂：TAK242(TLR4抑制剂)购自美国MCE公司;LPS(Nrf2激活剂)购自美国Invivogen公司;血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血清肌酐(serum creatinine,SCr)试剂盒购自上海科华生物工程股份有限公司;总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司;荧光定量PCR试剂盒购自上海Novoprotein公司;肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、TLR4、NF-κB p65抗体购自北京博奥森生物科技有限公司;IgG二抗购自美国Santa Cruz Biotechnology公司;ECL化学发光液购自上海天能科技有限公司。

2.动物分组、造模与给药：按随机数字表法将96只大鼠分为假手术(Sham)组、模型(Model)组、Model+TAK242组和Model+LPS组,每组24只。除Sham组外,其他组均参照易小敏等[7]报道的方法,夹闭双侧肾动脉45min复制RIR大鼠模型;Sham组行相同的手术通路,但不夹闭双侧肾动脉。给药：造模前7天开始,Model+TAK242组以TAK242 10mg/kg剂量腹腔注射给药,ASI+LPS组以LPS 5mg/kg剂量腹腔注射给药,Sham组和Model组腹腔注射0.9%氯化钠溶液,各组注射体积均为6ml/kg[8,9]。

3.血清肾功能指标检测：再灌注6h后,各组分别随机取12只大鼠,麻醉后经腹主动脉取血,3500r/min离心5min分离血清,通过全自动分析仪检测BUN、SCr水平。

4.HE染色法观察肾组织病理学改变及病理评分：取血完成后,颈椎脱臼处死大鼠,取左侧肾组织置于10%中性甲醛溶液中固定72h,经石蜡包埋、5μm厚度切片、二甲苯透明、梯度乙醇脱水处理后,行常规HE染色,通过光学显微镜观察肾组织病理学改变。400倍光学显微镜下,每张切片随机选取互不重叠的10个视野,根据Li等[10]报道的方法行病理评分：视野内未见病变记0分,病变面积占视野≤10%记1分、10%～25%(含)记2分、25%～50%(含)记3分、50%～75%记4分、>75%记5分。

5.透射电子显微镜观察肾小管上皮细胞超微结构变化：取部分右肾组织,修饰成1mm3小块后置于2.5%戊二醛溶液中固定48h,1%锇酸溶液中固定2h,环氧树脂包埋,50nm厚度超薄切片,醋酸铀染色30min、柠檬酸铅复染30min,通过透射电子显微镜观察肾小管上皮细胞超微结构变化。

6.肾组织TLR4、NF-κB p65mRNA表达检测：取各组剩余的12只大鼠,麻醉后在冰上取右侧肾脏组织100mg,冰上研磨匀浆,分离纯化总RNA、检测RNA浓度和纯度、将RNA反转录成cDNA后,行RT-PCR扩增反应,反应条件为95℃ 5min、95℃ 30s,62℃、30s,72℃、30s,进行40个循环,然后72℃延伸10min,4℃ 5min终止反应,通过凝胶分析仪成像。目的基因相对表达量采用2-ΔΔCt法计算(β-actin为内参)。RT-PCR引物序列详见表1。

表1 RT-PCR引物序列

7.肾组织TNF-α、IL-1β、TLR4、NF-κB p65蛋白表达检测：取右侧肾脏组织100mg,加入6倍量4℃裂解液研磨匀浆,4℃、12000r/min离心25min后取上清液,检测蛋白浓度后,SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白,湿法转膜、5%脱脂奶粉室温封闭1h后,TNF-α、IL-1β、TLR4、NF-κB p65、β-actin抗体4℃孵育过夜,IgG二抗37℃孵育1.5h,滴加ELC显色,以β-actin为内参半定量目标蛋白相对表达量。

结 果

1.各组大鼠血清BUN、SCr水平的比较：与Sham组比较,Model组血清BUN、SCr水平升高(P<0.05);与Model组比较,Model+TAK242组BUN、SCr水平降低(P<0.05),Model+LPS组BUN、SCr水平升高(P<0.05,图1)。

图1 各组大鼠血清BUN、SCr水平的比较(n=12)与Sham组比较,*P<0.05;与Model组比较,#P<0.05

2.各组大鼠肾组织病理学改变及病理评分的比较：Sham组肾小球、肾小管结构及细胞形态未见异常;Model组可见肾小球体积增大、系膜增生,肾小管管腔扩张、管型形成,细胞空泡变性,肾小球及间质区炎性细胞浸润;与Model组比较,Model+TAK242组肾小球、肾小管病理学改变及肾小球、间质区炎性细胞浸润均明显改善,Model+LPS组肾小球体积增大、系膜增生、肾小管管腔扩张、炎性细胞浸润等病理学改变明显加重。与Sham组比较,Model组病理评分升高(P<0.05);与Model组比较,Model+TAK242组病理评分降低(P<0.05),Model+LPS组病理评分升高(P<0.05,图2、图3)。

图2 各组大鼠肾组织病理学改变(HE染色,×400)A.Sham组;B.Model组;C.Model+TAK242组;D.Model+LPS组

图3 各组大鼠肾组织病理评分的比较(n=12)与Sham组比较,*P<0.05;与Model组比较,#P<0.05

3.各组大鼠肾小管上皮细胞超微结构改变的比较：Sham组大鼠肾小管微绒毛清晰完整,上皮细胞线粒体、内质网等细胞器结构未见异常。Model组可见肾小管微绒毛坏死脱落,上皮细胞部分坏死,可见线粒体肿胀、膜破裂、嵴断裂,内质网扩张,核糖体减少。与Model组比较,Model+TAK242组肾小管上皮细胞上述超微结构改变明显减轻,Model+LPS组上述超微结构病变明显加重(图4)。

图4 各组大鼠肾小管上皮细胞超微结构改变(醋酸铀和柠檬酸铅染色,×10000)A.Sham组;B.Model组;C.Model+TAK242组;D.Model+LPS组

4.各组大鼠肾组织TNF-α、IL-1β蛋白表达的比较：与Sham组比较,Model组TNF-α、IL-1β蛋白表达量升高(P<0.05);与Model组比较,Model+TAK242组TNF-α、IL-1β蛋白表达量降低(P<0.05),Model+LPS组TNF-α、IL-1β蛋白表达量升高(P<0.05,图5)。

图5 各组大鼠肾组织TNF-α、IL-1β蛋白表达的比较(n=12)与Sham组比较,*P<0.05;与Model组比较,#P<0.05

5.各组大鼠肾组织TLR4、NF-κB p65mRNA和蛋白表达的比较：与Sham组比较,Model组TLR4、NF-κB p65mRNA和蛋白表达量均升高(P<0.05);与Model组比较,Model+TAK242组TLR4、NF-κB p65mRNA和蛋白表达量均降低(P<0.05),Model+LPS组TLR4、NF-κB p65mRNA和蛋白表达量均升高(P<0.05,图6、图7)。

图6 各组大鼠肾组织TLR4、NF-κB p65mRNA表达的比较(n=12)与Sham组比较,*P<0.05;与Model组比较,#P<0.05

图7 各组大鼠肾组织TLR4、NF-κB p65蛋白表达的比较(n=12)与Sham组比较,*P<0.05;与Model组比较,#P<0.05

讨 论

肾脏血流灌注丰富,对缺血及再灌注过程非常敏感,RIR损伤是影响肾脏手术患者预后的重要因素,因此,防治RIR损伤一直是医学研究的热点。夹闭双侧肾动脉45min制备RIR大鼠模型具有操作简单、重复性好、与人类临床RIR病理特点近似的优点,是普遍认可的一种RIR动物模型制备方法。本研究发现,RIR模型大鼠血清BUN、SCr水平明显升高,肾组织呈现肾小球体积增大、系膜增生,肾小管管腔扩张、管型形成,细胞空泡变性,肾小球及间质区可见炎性细胞浸润等病理学改变,病理评分明显升高,与牟俊杰等[11]研究报道一致。肾小管上皮细胞可见部分坏死以及线粒体肿胀、膜破裂、嵴断裂,内质网扩张,核糖体减少等超微结构病变,与周海涛等[12]和陈明霞等[13]研究报道一致。

炎性反应是组织缺血再灌注损伤发生、发展的关键因素,有研究发现RIR诱发中性粒细胞聚集并释放炎性细胞因子、黏附分子等,诱发炎性反应并促进炎性细胞浸润[14]。炎性细胞因子TNF-α、IL-1β除了能够诱发炎性反应外,还能趋化中性粒细胞等进一步释放炎性细胞因子而加重炎性反应[15]。TLR是一种跨膜识别受体,其中TLR4能够特异性识别革兰阴性菌胞壁上的脂多糖,介导促炎性细胞因子释放而激发炎性反应[16]。NF-κB为TLR4下游靶基因,是由p50/p65二聚体形成的一种核转录因子,核转位后p65亚基能够与DNA特异性位点结合而诱导炎性细胞因子表达,进而加重炎性反应[17]。刘紫阳等[18]研究发现,TAK242通过抑制TLR4蛋白表达而减轻炎性反应,对脓毒症大鼠心肌损伤起到保护作用。钟祥等[19]研究发现,TAK242能够抑制TLR4及炎性细胞因子(IL-1β、IL-6)表达,减轻心脏死亡大鼠肝脏缺血再灌注损伤。

本研究发现,RIR模型大鼠肾组织TNF-α、IL-1β蛋白表达量明显升高,TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表达量均明显提高;TLR4抑制剂TAK242能够明显降低RIR大鼠肾组织TNF-α、IL-1β蛋白表达量,降低TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表达量;TLR4激活剂LPS则明显提高RIR大鼠肾组织TNF-α、IL-1β蛋白表达量,提高TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表达量。

综上所述,TLR4/NF-κB信号通路可能通过调节炎性反应参与RIR损伤过程,可作为防治RIR损伤的新靶点。接下来笔者课题组将探索以TLR4/NF-κB通路为作用靶点、能够防治RIR损伤的新型药物。