丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶11在泛癌的发生和预后中的作用及免疫分析

凌永嫦，李妹燕，仇雯丽，廖陆生，董明右，王俊利

（右江民族医学院 1.附属医院产科；2.检验学院，广西 百色 533000）

世界卫生组织2018年报告全球新发肿瘤约180万例，死亡约950万例，目前对于绝大部分肿瘤没有特效的治疗方法，肿瘤严重影响着人们的生活［1］。肿瘤免疫在肿瘤的发生发展和预后中起着关键作用。近年来免疫疗法在肿瘤治疗中逐渐开展，尤其是免疫检查点阻断疗法［2］。

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶11（serine-threonine kinase 11，STK11）也称为肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1），位于人类染色体19p13.3区域，在调节细胞生长、存活和代谢中起重要作用［3］。STK11缺失与结直肠癌患者的不良预后密切相关［4］。树突状细胞中STK11缺失可通过诱导肿瘤中调节性T细胞增加，促进肿瘤的生长［5］。STK11在肝癌中过表达且与不良预后显著相关［6］，可影响大多数恶性肿瘤患者的预后。

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迄今为止，有关STK11在肿瘤中的研究仅限于特定类型的肿瘤。尚无关于STK11与各种肿瘤之间关联的泛癌研究。随着公共数据库的不断发展和完善，可对基因进行泛癌表达分析并评估其与临床预后及免疫的相关性［7］。因此，本研究利用数据库分析STK11表达与各种肿瘤发生、预后及免疫的关系。

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1 材料与方法

1.1 信息获取

通过R软件包“edge”分析正常组织和肿瘤组织中STK11表达水平的差异。Kruskal Wallis检验用于分析STK11在不同正常组织和不同肿瘤细胞系中的表达水平。采用R软件包“ggplot”绘图。

式（3）中，XHC为人力资本存量，Ei表示i教育层次的员工比重，Hi表示i教育层次员工的受教育年限。本文将教育层次分为4层：专科以下学历、专科学历、本科学历、研究生学历（硕士和博士），受教育年限分别为12年、15年、16年、19年。

1.2 STK11在泛癌中的表达

各种肿瘤和正常组织的基因表达水平和临床信息数据来自GTEx数据库（https：//gtexportal.org/）和TCGA数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov/）。其中，31种癌症纳入GTEx基因表达分析，27种癌症纳入GTEx整合分析。每个肿瘤细胞系的表达数据取自CCLE数据库（https：//portals.broadinstitute.org/）。本研究采用ESTIMATE算法计算每个肿瘤样品的免疫评分、基质评分和综合评分。TIMER数据库下载33种癌症的6种免疫浸润细胞的得分数据。

1.3 STK11表达与肿瘤患者预后之间的关系

采用ESTIMATE算法计算每个肿瘤样品的免疫评分、基质评分和综合评分，并使用R软件包“estimate”和“ limma”根据免疫浸润程度评估STK11表达与以上3种评分之间的关系。此外，本研究从TIMER数据库下载了33种肿瘤的6种免疫浸润细胞的得分数据，采用R软件包评估STK11表达与每种免疫细胞浸润水平之间的相关性。

1.4 STK11表达与免疫评分、基质评分和综合评分及免疫浸润的关系

采用单变量生存分析方法分析STK11表达与患者生存率的相关性，Kaplan-Meier方法和对数秩检验方法用于比较不同STK11表达水平的存活率。采用二分法将STK11在肿瘤及邻近非癌组织中的表达水平分为STK11高表达组和低表达组。通过R软件包“ survival”和“ survminer”进行单变量 Cox回归分析，并绘制生存曲线。

1.5 统计学分析

采用R包 Estimate 分析单个肿瘤样本的免疫评分、基质评分和综合评分，33种肿瘤中STK11表达与免疫评分相关性最显著的前3个肿瘤为多形胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）（r=-0.358，P＜ 0.001）、LUSC（r=-0.208，P＜ 0.001）和SARC（r=-0.261，P＜ 0.001），STK11表达与基质评分最显著相关的前3个肿瘤是 ACC（r=-0.429，P＜ 0.001）、甲状腺癌（thyroid carcinoma，THCA）（r=-0.153，P＜ 0.001）和GBM（r=-0.358，P＜ 0.001），STK11表达与综合评分最显著相关为ACC（r=-0.429，P＜ 0.001）、LUSC（r=-0.208，P＜ 0.001）和 GBM（r=-0.358，P＜ 0.001）。这些结果表明，6种肿瘤中STK11表达与这3种评分均呈显著负相关，见图3。

2 结果

2.1 STK11在正常组织和肿瘤之间的差异表达

针铁矿能够对重金属离子发生吸附作用，是由于针铁矿表面具有多种活性羟基结构，这些羟基能够与重金属离子发生螯合作用。为进一步表征针铁矿的表面羟基化程度，对针铁矿样品进行酸碱滴定，滴定结果如图8所示。

图1 STK11在肿瘤组织和正常组织中的表达Fig.1 Differential expression of STK11

2.2 STK11在各种肿瘤中的预后价值

本研究分析33种肿瘤中STK11表达与6种免疫细胞得分的相关性，结果显示，STK11表达水平在7种肿瘤中与B细胞得分呈正相关，18种肿瘤中与CD4+T细胞得分呈正相关，4种肿瘤中与CD8+T细胞得分呈正相关，6种肿瘤中与中性粒细胞和巨噬细胞得分呈正相关，7种肿瘤中与树突状细胞得分呈正相关。此外，STK11表达水平在16种肿瘤中与CD8+T细胞得分呈负相关，6种肿瘤中与中性粒细胞得分呈负相关，11种肿瘤中与巨噬细胞得分呈负相关，3种肿瘤中与树突状细胞得分呈负相关（表2）。在最显著相关的3种肿瘤中，LIHC和LUAD的STK11表达水平与B细胞、CD4+T细胞、中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞得分均呈显著正相关；而在COAD患者中，STK11表达水平与B细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞得分均呈显著负相关，与CD4+T细胞呈正相关（图4）。

GTEx数据库分析结果显示，STK11基因在大多数正常组织中过表达，其中睾丸组织中的表达水平最高（图1A）。CCLE数据库中21种不同正常组织的分析结果显示，STK11在大多数正常细胞中高表达（P＜ 0.001）（图1B），与GTEx数据的分析结果一致。各种肿瘤组织与邻近非癌组织中STK11差异表达分析结果显示，STK11在绝大多数肿瘤中表达上调，其中在胆管癌（cholangiocarcinoma，CHOL）和肝细胞癌（liver hepatocellular carcinoma，LIHC）的表达为极显著上调（P＜ 0.001）；但在肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）、肾嫌色细胞癌（kidney chromophobe，KICH）、肾透明细胞癌（kidney renal clear cell carcinoma，KIRC）、胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD）和子宫内膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC）中表达呈下调（P＜ 0.01），见图1C。考虑到TCGA中部分肿瘤样品缺失癌旁样品，本研究整合GTEx数据库中正常组织的数据和TCGA肿瘤组织的数据，进行了STK11在27个肿瘤中的表达差异分析；结果显示，在22种类型的肿瘤和正常组织之间检测到STK11的显著差异表达，STK11在CHOL、头颈部鳞状细胞癌（headand neck squamous cell carcinoma，HNSC）、KICH、肺鳞状细胞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）、PAAD和直肠腺癌（rectum adenocarcinoma，READ）中的表达显著上调，而在宫颈癌（cervical and endocervical cancer，CESC）、子宫肉瘤（uterine carcinosarcoma，UCS）、READ、食管癌（esophageal carcinoma，ESCA）和肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）等16种肿瘤中STK11表达明显低于正常组织，见图1D。

表1 STK11表达与33种肿瘤OS的关系Tab.1 Relationship between STK11 expression and OS in 33 tumors

图2 STK11表达与7种肿瘤 OS的关系Fig.2 Kaplan-Meier analysis of the association between STK11 expression and OS of 7 types of tumors

2.3 STK11表达与免疫评分、基质评分和综合评分的关系

采用R软件（版本4.0.2）对数据进行统计分析，组间比较采用t检验，生存分析采用Kaplan-Meier法、log-rank检验和Cox比例风险回归模型，2个变量之间的相关性分析采用Spearman检验或Pearson检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

图3 STK11表达与免疫评分、基质评分和综合评分相关性最高的3种肿瘤Fig.3 STK11 expression in the three tumors with the highest correlation between immune score，matrix score，and ESTIMATE score

2.4 STK11表达水平与免疫浸润水平的关系

对33种肿瘤中STK11表达水平与预后结局进行关联分析。结果显示，STK11表达水平与肾上腺皮质瘤（adrenocortical carcinoma，ACC）、HNSC、急性粒细胞白血病（acute myeloid leukemia，LAML）、低级别脑胶质瘤（brain lower grade glioma，LGG）、LIHC、肉瘤（sarcoma，SARC）和UCEC等7种肿瘤类型的总生存期（overall survival，OS）相关（P＜ 0.05），见表1。其中，STK11在ACC、LAML、LGG、LIHC和SARC中属于高风险基因（HR＞1），而在HNSC（HR=0.97）和UCEC（HR=0.98）中属于低风险基因。Kaplan-Meier生存分析结果显示，在HNSC和UCEC中STK11表达水平高的患者OS更长；而在ACC、LAML、LGG和LIHC患者中，STK11高表达患者OS更短，见图2。

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表2 不同肿瘤中STK11表达与免疫细胞浸润的关系Tab.2 Relationship between STK11 expression and immune cell infiltration in different cancers

图4 COAD、LIHC和LUAD中STK11表达与免疫细胞浸润的相关性Fig.4 Correlation analysis between STK11 expression and tumor immune infiltration in COAD，LIHC，and LUAD

3 讨论

通过TCGA数据库研究STK11在各种癌和癌旁组织中的表达情况，结果显示，STK11基因在胆管癌、肝癌等14种肿瘤中高表达。BARBIER-TORRES等［8］研究表明STK11在肝癌中过表达并致癌，预后较差的患者中STK11水平进一步升高。然而，HUANG等［9］发现肝癌患者中STK11表达下降。这与本研究结果不一致，可能与肿瘤类型、分级、分期或者不同的种族遗传背景有关，也可能是因为STK11虽然被确定为肿瘤抑制因子，但也可能表现出促癌功能［6］。此外，在转移性乳腺癌细胞系中，STK11蛋白水平降低，并促进了乳腺癌的转移和侵袭；STK11表达水平在乳腺癌的不同阶段之间差异很大，并且可能与肿瘤转移和患者预后相关［10］。本研究为STK11作为泛癌预后标志物的应用提供了见解，有助于未来机制研究的潜在发展。

Kaplan-Meier生存分析结果显示，STK11高表达与肾上腺皮质癌和脑低级别胶质瘤患者的不良预后有关。同样，STK11高表达与肝癌不良预后相关，提示STK11可能是肝癌潜在的预后生物标志物［9］。相反，在患有胰腺癌、胸腺癌和子宫内膜癌的患者中，STK11高表达与良好的预后相关。据报道［11］，胰腺导管腺癌患者中STK11表达降低，且与患者的不良生存有关。总之，STK11可能作为多种肿瘤预后的生物标志物。

免疫微环境作为评估肿瘤细胞对免疫疗法反应的标志物，影响临床结果，STK11在肿瘤免疫中起着至关重要的作用［12-13］。浸润的肿瘤免疫细胞对肿瘤的发生和发展有重要影响，并且可以拮抗或促进肿瘤的发生和发展［14］。前期研究［15］已表明肿瘤抑制基因STK11的失活除了对细胞周期、代谢、分化、极性和其他细胞途径的影响外，还会导致肿瘤微环境的显著变化。肺癌患者中，STK11缺乏可以促进免疫抑制微环境，并可能参与抗pd-1/抗pd-L1的初级抗药［16］。同时，发生STK11突变的肺腺癌患者，免疫细胞浸润减少，接受免疫检查点抑制剂的患者预后更差［17］。本研究结果显示，在33种肿瘤中，有6种肿瘤的STK11表达水平与免疫评分、基质评分和细胞浸润评分均呈显著负相关。其中，在肝细胞癌与肺腺癌患者中，STK11表达水平与B细胞、CD4+T细胞、中性粒细胞、树突状细胞及巨噬细胞的正相关性极为显著。TIMER数据库结果显示STK11具有参与多种肿瘤，尤其是肝细胞癌和肺腺癌的免疫调节。

综上所述，本研究对STK11在各种恶性肿瘤的分析结果显示，STK11基因在肿瘤和正常组织之间存在差异表达，且STK11表达与肿瘤预后相关。此外，STK11可能作为许多肿瘤的预后生物标志物，对于不同的肿瘤，其表达水平的高低将带来不同的预后结果，需进一步研究STK11在每种肿瘤中的具体作用。此外，STK11表达与肿瘤微环境及免疫细胞浸润之间存在相关性。其对肿瘤免疫力的影响也随肿瘤类型而变化。这些发现可能有助于阐明STK11在肿瘤发生和发展中的作用，并可能为恶性肿瘤提供一些基于免疫的抗肿瘤治疗策略，从而实现更精确和个性化的免疫治疗。