CYP3A5、ABCB1和POR基因多态性对肾移植受者他克莫司浓度、剂量及肾功能的长期影响

刘子琦,邹素兰,钱卿,凌静,蒋艳,胡楠

他克莫司(FK506)属于大环内酯类免疫抑制剂,通过选择性抑制钙调蛋白依赖的蛋白磷酸酶,抑制T细胞的正常功能,进而抑制一些细胞因子(如白介素)的形成,是目前临床上用于预防和治疗器官移植患者免疫排斥反应的一线治疗药物。一方面FK506治疗窗窄,仅在5～20 ng/mL范围内,血药浓度过高会引起肝、肾毒性,浓度过低则导致排斥反应[1];另一方面,患者的生理状态、体重、年龄、种族及合并用药情况等方面存在个体差异[2-3],从而影响机体对药物的处置过程,为了患者用药安全则必须进行血药浓度监测。随着遗传药理学和基因组学的发展,越来越多的研究发现基因多态性是影响FK506血药浓度的重要因素。FK506经肝脏细胞色素P450代谢,主要包括CYP3A4和CYP3A5,其中研究最多的单核苷酸基因多态性(SNP)属CYP3A5*3。本课题组前期研究[4]已经证实了CYP3A5*3、ABCB1C1236T、ABCB1 C3435T和POR*28基因多态性对肾移植初期患者FK506浓度剂量有影响,且ABCB1 C3435T基因多态性对肾移植患者初期的肾功能有影响。但CYP3A5、ABCB1和POR的基因多态性对FK506浓度、剂量以及对肾移植受者肾功能长期影响的研究相对较少,研究结果[5-6]尚不统一。因此,本文通过对我院肾移植术后长期随诊的患者进行基因分型,探究CYP3A5、ABCB1 C1236T、ABCB1 C3435T和POR基因多态性对FK506血药浓度、剂量、浓度剂量比及肾功能(以eGFR评估)的长期影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本研究经我院医学伦理委员会审批同意,选取2003年1月21日—2020年4月22日我院接受同种异体肾移植手术且行长期门诊随访的肾移植受者为研究对象。纳入标准:(1)年龄≥18岁;(2)肾移植术后使用以FK506为基础免疫抑制药的三联抗排异方案;(3)未联合使用CYP3A酶抑制剂(如氟康唑、西咪替丁等)或诱导剂(如苯巴比妥、卡马西平等)。排除标准:(1)行肾移植术≥2次的患者;(2)三联抗排异方案中从环孢素改用FK506的患者;(3)术后使用CYP3A4抑制剂(如质子泵抑制剂、他汀类药物、五味子制剂等)升高FK506血药浓度的患者[7]。本研究共纳入患者320例,其中男223例,女97例;平均年龄(39.03±10.14)岁,肾移植术后中位时间为34(3,209)个月。所有肾移植受者术后均采用FK506、霉酚酸类联合肾上腺糖皮质激素的三联免疫抑制方案,均知悉研究内容并签署知情同意书。相关病案信息从我院电子病例系统中收集,FK506浓度与剂量数据从我科自主研发的TDM数据库中收集。

1.2 标本采集 患者服用FK506达稳态后,于早晨服药前半小时静脉采血2～3 mL,用乙二胺四乙酸二钾抗凝管收集血样标本。取一部分血样用于血药浓度测定,剩余标本保存于-80 ℃冰箱用于基因测序。

1.3 FK506血药浓度测定及eGFR计算 采用酶免疫放大法[8]测定FK506血药浓度。从西门子医学诊断产品有限公司购入实验所需药物浓度分析仪(Viva-E)、Emit 2000他克莫司检测试剂盒、标准曲线和质控试剂盒。肾小球滤过率根据CKD-EPI公式[9]计算得出。

1.4 基因型分析 首先采用PCR-RFLP技术对纳入的研究对象DNA进行扩增。详细的DNA提取步骤、PCR引物设计、PCR反应体系和扩增条件见前期研究[7-8]。其次,使用日本HitachiHigh-Technologies公司 DNA 测序仪对上一步的 PCR 扩增产物进行测序;得到四组(CYP3A5*3、ABCB1 C1236T、ABCB1 C3435T、POR*28)基因分型。

2 结果

2.1 等位基因及基因型频率分布 CYP3A5*3、ABCB1 C1236T、ABCB1 C3435T和POR*28基因突变频率分别为69.84%、63.44%、37.81%和35.00%。基因型及等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),研究资料具有群体代表性。见表1。

表1 CYP3A5、ABCB1、POR基因型和等位基因频率

2.2 CYP3A5 基因多态性对FK506浓度、剂量及浓度剂量比的影响 CYP3A5 非表达者的血药浓度在移植后1、4年高于CYP3A5表达者(P=0.0067,P=0.0004),CYP3A5表达者的FK506剂量在移植后8年间均高于非表达者(P=0.0004),CYP3A5表达者浓度剂量比在移植后8年间均低于非表达者(P=0.0060),差异有统计学意义。

1A CYP3A5基因多态性对FK506浓度的影响 1B CYP3A5基因多态性对FK506剂量的影响1C CYP3A5基因多态性对FK506浓度剂量比的影响图1 CYP3A5基因多态性对FK506浓度、剂量及浓度剂量比的影响

2.3 ABCB1基因多态性对FK506浓度、剂量和浓度剂量比的影响 本研究在CYP3A5分型的基础上,研究ABCB1 C3435T和C1236T基因型对FK506浓度、剂量和浓度剂量比的影响。在CYP3A5表达者(n=157)中,ABCB1 3435 CC型患者共51例(占32.48%),CT型共81例(占51.59%),TT型共25例(占15.92%)。ABCB1 1236 CC型患者共22例(占14.01%),CT型共71例(占45.22%),TT型共64例(占40.76%)。在CYP3A5非表达者(n=163)中,ABCB1 3435 CC型患者共72例(占44.17%),CT型共71例(占43.56%),TT型共20例(占12.27%)。ABCB1 1236 CC型患者共19例(占11.66%),CT型共81例(占49.69%),TT型共63例(占38.65%)。ABCB1 3435基因多态性对2组不同CYP3A5表型患者的FK506的浓度、剂量及浓度剂量比均无影响,差异无统计学意义(P=0.3040)。见表2。ABCB1 3435和1236基因多态性对2组不同CYP3A5表型患者的FK506的浓度、剂量及浓度剂量比均无影响,差异均无统计学意义(P=0.3040,0.1190)。见图2、图3。

2A ABCB1 3435对CYP3A5表达者FK506浓度的影响 2B ABCB 13435对CYP3A5表达者FK506剂量的影响2C ABCB1 3435对CYP3A5表达者FK506浓度剂量比的影响 2D ABCB1 3435对CYP3A5非表达者FK506浓度的影响2E ABCB1 3435对CYP3A5非表达者FK506剂量的影响 2F ABCB1 3435对CYP3A5非表达者FK506浓度剂量比的影响图2 ABCB1 3435对CYP3A5表达者和非表达者FK506浓度、剂量及浓度剂量比的影响

3A ABCB1 1236对CYP3A5表达者FK506浓度的影响 3B ABCB1 1236对CYP3A5表达者FK506剂量的影响3C ABCB1 1236对CYP3A5表达者FK506浓度剂量比的影响 3D ABCB1 1236对CYP3A5非表达者FK506浓度的影响3E ABCB1 1236对CYP3A5非表达者FK506剂量的影响 3F ABCB1 1236对CYP3A5非表达者FK506浓度剂量比的影响图3 ABCB1 1236对CYP3A5表达者和非表达者FK506浓度、剂量及浓度剂量比的影响

表2 CYP3A5分型后ABCB1 C3435T、C1236T和POR*28基因分型情况

2.4 POR*28基因多态性对FK506浓度、剂量及浓度剂量比的影响 根据CYP3A5*3分型后,分别统计POR*28基因多态性对CYP3A5表达者和非表达者FK506浓度、剂量及浓度剂量比的影响。根据CYP3A5*3分型后,分别统计POR*28基因多态性对CYP3A5表达者和非表达者FK506浓度、剂量及浓度剂量比的影响。在CYP3A5表达者(n=157)中,POR*28 CC型患者共58例(占36.94%),CT型共78例(占49.68%),TT型共21例(占13.38%)。在CYP3A5非表达者(n=163)中,POR*28 CC型患者共73例(占44.79%),CT型共76例(占46.63%),TT型共14例(占8.59%)。见表2。POR*28基因多态性对2组不同CYP3A5表型患者的FK506浓度、剂量及浓度剂量比无影响,差异无统计学意义(P=0.345)。POR*28基因多态性对2组不同CYP3A5表型患者的FK506浓度、剂量及浓度剂量比无影响,差异无统计学意义(P=0.345)。见图4。

4A POR*28对CYP3A5表达者FK506浓度的影响 4B POR*28对CYP3A5表达者FK506剂量的影响4C POR*28对CYP3A5表达者FK506浓度剂量比的影响 4D POR*28对CYP3A5非表达者FK506浓度的影响4E POR*28对CYP3A5非表达者FK506剂量的影响 4F POR*28对CYP3A5非表达者FK506浓度剂量比的影响图4 POR*28对CYP3A5表达者和非表达者FK506浓度、剂量及浓度剂量比的影响

图5 CYP3A5基因型对肾移植受者eGFR水平的影响

2.5 CYP3A5基因多态性对肾移植受者eGFR水平的影响 CYP3A5非表达者的eGFR水平在移植3个月(P=0.0240)、6个月(P=0.0187)和2年(P=0.0309)后高于CYP3A5表达者,差异有统计学意义;而在移植1年后2组eGFR水平比较差异无统计学意义(P=0.1130)。

3 讨论

本课题组前期研究[7-8]已经证实CYP3A5*3、ABCB1 C1236T、ABCB1 C3435T和POR*28基因多态性均对FK506浓度和剂量产生影响,并且ABCB1 C3435T基因多态性影响移植初期肾功能(以肌酐和胱抑素C为评价指标)。由于FK506治疗窗窄、个体差异大,所以长期门诊随访进行治疗药物和肾功能的监测对于提升肾移植受者的生存率意义重大[10]。我院临床药学研究室开展FK506 TDM已有多年,搭载肾移植平台,为辅助临床精准用药,累计记录近10年随访的肾移植受者FK506相关数据。本研究在前期研究基础上扩大样本量,选取320例肾移植患者CYP3A5、ABCB1和POR基因多态性对FK506浓度、剂量和肾功能长期影响进行分析和探讨。

FK506经肝脏细胞色素P450代谢,主要包括CYP3A4和CYP3A5,其中研究最多的单核苷酸基因多态性(SNP)属CYP3A5*3[11]。由于第3内含子6986位点A>G突变,导致CYP3A5酶活性降低,CYP3A5*3*3基因携带者(非表达者)的酶活性低于CYP3A5*3*1和CYP3A5*1*1(表达者)[12-14],使得CYP3A5非表达者C/D更高,需要的FK506剂量更少,本研究结果与之统一。CYP3A5*3基因多态性对肾移植受者FK506的剂量、浓度和浓度剂量比有影响,在移植后1、4年CYP3A5表达者FK506的血药浓度显著低于CYP3A5非表达者,同时CYP3A5表达者浓度剂量比在移植后3个月到8年间多个时间点显著低于非表达者,而ABCB1 C1236T、ABCB1 C3435T和POR*28基因多态性对肾移植受者长期FK506的浓度、剂量没有显著性影响。一项对南非患者的研究[15]认为CYP3A5基因多态性影响FK506剂量需求。Yildirim等[16]研究也一致认为CYP3A5基因多态性而不是ABCB1基因多态性影响FK506药动学特征和肾移植受者的剂量需求。

根据目前国内外学者的研究,关于CYP3A5*3和ABCB1基因多态性对肾移植受者肾功能的影响尚未得出统一结论。马多玲等[6]研究结果显示ABCB1 G2677T/A和C3435T基因多态性对术后12个月以上的肾移植受者肾功能有影响。Genvigir等[17]研究发现CYP3A5*3基因多态性对肾移植术后第90天的eGFR有影响,但缺少对移植术90天后CYP3A5*3基因多态性与eGFR的相关研究。与之相反的是,Flahault等[18]研究则表明CYP3A5*3基因多态性并不影响肾移植受者术后3个月、1、2年甚至更长时间的eGFR。Cheung等[19]研究发现肾移植术后1个月,CYP3A5表达组和非表达组的eGFR相当,移植后6个月、1、5年至10年都没有显著差异。本文通过对我院320例肾移植受者的研究发现,CYP3A5*3基因多态性对肾移植受者3、6个月和2年的eGFR有相关性,与上述研究结论部分一致,而ABCB1 C3435T基因多态性对CYP3A5表达者的长期肾功能无显著影响。影响移植肾功能的因素较多,且难以通过单一指标评价,而本研究仅计算eGFR,缺乏其他指标(如肌酐清除率、胱抑素C等)[20]对CYP3A5*3和ABCB1基因多态性与肾功能的关系进行综合评估,相关研究仍待进一步完善。

综上所述,CYP3A5*3基因多态性对我院肾移植受者长期的FK506浓度、剂量及浓度剂量比有显著性影响,CYP3A5非表达者FK506的血药浓度更高,所需的日剂量更低,且CYP3A5*3基因多态性与患者eGFR水平有相关性。通过对患者进行CYP3A5、ABCB1和POR基因检测,并结合TDM结果,共同优化肾移植术后长期的个体化抗排异方案,监护患者用药安全。