雷公藤甲素对类风湿关节炎破骨细胞分化影响及机制

范文强 郭占非 张超 边彩月 高晓 许振丹

［摘要］ 目的 探讨雷公藤甲素（TP）对类风湿关节炎（RA）破骨细胞（OC）分化的影响及其机制。

方法 选取2019年9月—2020年8月到我院进行治疗的RA病人20例，分离RA病人外周血单个核细胞（PBMC），通过核因子κB受体活化因子配体（RANKL）和巨噬细胞集落刺激因子（M－CSF）诱导培养为OC，分别用不同浓度的TP（浓度为10、20、40 nmol/L）干预OC，记为TP各剂量组，未经过TP干预的OC作为对照组。使用细胞计数试剂盒（CCK－8）法测定细胞增殖，流式细胞术测定细胞凋亡，ELISA法检测相关炎症因子表达，实时荧光定量PCR（qRT－PCR）测定标志性基因和分化相关转录因子表达，蛋白质印迹（Western blot）测定p－IκB蛋白以及分化相关转录因子蛋白表达。

结果 与对照组比较，TP各组RA－OC存活率及炎症因子表达呈剂量效应关系降低（F=95.702～185.246，P<0.01），RA－OC凋亡率升高（F=306.798，P<0.01）；而Trap、Ctsk、CTR、MMP－9 mRNA表达下调（F=141.455～266.411，P<0.01），NFATcl、c－Fos、c－Jun mRNA和蛋白表达均降低，p－IκB蛋白表达也相应降低（F=130.683～351.640，P<0.01）。

结论 TP可能通过抑制NF－κB信号通路减轻RA病人OC分化，并抑制细胞增殖和炎症反应，以及诱导OC凋亡。

［关键词］ 关节炎，类风湿；雷公藤甲素；破骨细胞；细胞分化；NF－κB；信号通路

［中图分类号］ R593.22;R284

［文献标志码］ A

［文章编号］ 2096－5532（2023）02－0232－05

类风湿关节炎（RA）是一种病因未明的慢性、以滑膜炎为主要表现的系统性疾病，其特征是手、足小关节的多关节、对称性、侵袭性关节炎症反应。破骨细胞（OC）是骨吸收的主要功能细胞，在骨发育、生长、修复、重建中具有重要的作用，它起源于血系单核－巨噬细胞系统，是一种特殊的终末分化细胞，它可由其单核前体细胞通过多种方式融合形成巨大的多核细胞。有研究表明，RA病人OC增殖活性增加，OC还能介导骨破坏，是RA关节破坏的主要原因。雷公藤甲素（TP）是雷公藤的主要活性成分之一，它具有抗氧化、抗老年性痴呆症、抗癌等功效。TP还能减缓RA大鼠关节损伤。但是关于TP对类风湿关节炎－破骨细胞（RA－OC）的影响及其机制还不清楚，本实验主要研究TP对RA－OC分化的影响及其潜在的调控通路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 人体外周血标本 2019年9月—2020年8月，选取到我院进行治疗的RA病人20例，其中男10例，女10例，平均年龄（55.64±8.31）岁。采集外周静脉血8 mL。 病人到我院之前均未接受过治疗（病情无活动）。RA诊断均符合2010年的ACR/EULAR分类标准，排除了患有严重心血管疾病、肝肾功能障碍、恶性肿瘤及系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎等其他免疫疾病的病人。本研究已经获得本院伦理委员会批准（批号：2020－142），所有病人均知情同意。

1.1.2 试剂和药物 DMEM培养液购自美国HyClone公司；胎牛血清、胰蛋白酶购自美国BD公司；核因子κB受体活化因子配体（RANKL）和巨噬细胞集落刺激因子（M－CSF）购自美国Pepro Tech公司；CCK－8试剂盒购自日本Dojindo公司；膜联蛋白V－异硫氰酸荧光素（Annexin V－FITC）和碘化丙啶（PI）试剂盒均购自美国Bio－Rad公司；Trizol试剂、逆转录试剂盒、实时荧光定量（qRT－PCR）试剂盒购自美国Invitrogen公司；RIPA裂解液、二辛可宁酸（BCA）试剂盒、PVDF膜购自瑞士Roche公司。TP购自美国Sigma公司（批号：MKBQ7748V）。

1.2 研究方法

1.2.1 TP试剂的配制 取TP药物1 mg溶解于277.8 μL的DMSO溶液中，配制成10 mmol/L溶液，取其中1 μL配制成10 μmol/L溶液。最终将TP稀释成10、20、40 nmol/L的溶液。

1.2.2 RA－OC培养 采用密度梯度离心法分离RA病人外周血单个核细胞（PBMC），將PBMC接种于培养皿中，密度为2×106 /cm2，孵育3 h。用胰蛋白酶将消化后的贴壁细胞接种于24孔板中，密度为2×105/cm2。用含体积分数0.10胎牛血清及RANKL（100 μg/L）、M－CSF（50 μg/L）的DMEM培养液培养PBMC，每2～3 d换液1次，最终形成RA－OC。采用细胞形态学观察、TRAP染色及骨吸收试验对RA－OC进行鉴定。

1.2.3 实验分组 将RA－OC接种于96孔培养板中，分为对照组（A组）和3个不同浓度TP干预组（B组、C组、D组），每组3例。A组加入相应浓度的DMSO，TP浓度为0 nmol/L；B组、C组、D组分别用不同浓度TP（10、20、40 nmol/L）干预。每组做3个复孔，每个实验重复3次。

1.2.4 CCK8法测定RA－OC存活率 RA－OC细胞以1×107/L密度接种至96孔板，细胞培养24 h，每孔加入10 μL的CCK－8试剂，孵育2 h，终止培养，在490 nm波长下检测细胞吸光度（A）值。细胞存活率（%）=待测样品A490/对照A490×100%。

1.2.5 流式细胞术测定RA－OC凋亡率 RA－OC细胞用预冷的PBS洗涤，重悬于结合缓冲液中，调整密度为1×109/L。取100 μL细胞悬液添加到5 mL的流式管中，分别加入5 μL的Annexin V/FITC和PI，孵育15 min，取400 μL的1×结合缓冲液添加到试管中，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.6 ELISA法检测肿瘤坏死因子α（TNF－α）和白细胞介素6（IL－6）表达 RA－OC离心后收集细胞上清液，然后按照TNF－α试剂盒和IL－6试剂盒说明书操作步骤检测其表达水平。

1.2.7 qPT－PCR方法测定RA－OC中Trap、Ctsk、CTR、MMP－9、NFATcl、c－Fos、c－Jun mRNA表达  用Trizol提取各组RA－OC总RNA，再将其合成cDNA，最后，按照qRT－PCR试剂盒要求进行扩增反应。以GAPDH为内参照，使用2－△△Ct法计算相对表达量。循环条件：95 ℃、15 min，94 ℃、15 s，55 ℃、30 s，70 ℃、30 s，共40个循环。所用引物名称及其序列见表1。

1.2.8 Western blot测定p－IκB蛋白及分化相关转录因子蛋白表达 用RIPA裂解液裂解RA－OC并提取细胞中的总蛋白，用BCA试剂盒检测蛋白浓度。SDS－PAGE试剂盒分离细胞蛋白，并转移到PVDF膜上。以质量浓度50 g/L脱脂牛奶封闭膜后，在4 ℃条件下与适当的一抗孵育过夜。然后，用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育膜，滴加ECL化学显色、定影。以β－actin为内参照，利用增强型化学发光检测试剂盒检测目的蛋白灰度值。

1.3 统计学分析

利用SPSS 22.0统计软件分析数据。计量资料以±s形式表示。多组间均数比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK－q检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TP对RA－OC增殖影响

与A组比较，B组、C组和D组RA－OC的存活率显著降低（F=159.408，P<0.01），并呈浓度依赖性。见表2。

2.2 TP对RA－OC凋亡影响

与A组比较，B组、C组和D组 RA－OC的凋亡率显著升高（F=306.798，P<0.001），并呈浓度依赖性。见表2和图1。

2.3 TP对RA－OC炎症反应相关指标影响

与A组相比较，B组、C组和D组 RA－OC的TNF－α和IL－6表达水平显著降低（F=185.246、95.702， P<0.01），且呈浓度依赖性。见表3。

A：对照组（TP为0 nmol/L）；B：10 nmol/L的TP干预组；C：20 nmol/L的TP干预组；D：40 nmol/L的TP干预组。

与A组细胞比较，B组、C组和D组RA－OC的Trap、Ctsk、CTR、MMP－9 mRNA表达明显降低（F=141.455～266.411，P<0.01），并呈浓度依赖性。见表4。

2.5 TP对RA－OC中分化相关转录因子表达影响

与A组细胞比较，B组、C组和D组RA－OC的NFATcl、c－Fos、c－Jun mRNA和蛋白表达明显降低（F=173.559～351.640，P<0.01），呈浓度依赖性。见表5和图2。

2.6 TP对NF－κB信号通路相关蛋白p－IκB表达影响结果表明，A组、B组、C组与D组RA－OC的p－IκB蛋白的相对表达量分别为0.95±0.09、0.76±0.07、0.53±0.05和0.40±0.03。与A组相比较，B组、C组和D组RA－OC的p－IκB蛋白表达明显降低（F=130.683，P<0.01），且呈浓度依赖性。见图3。

3 讨论

RA是一种严重的慢性自身免疫性炎症性疾病，关节炎的病理改变主要有滑膜衬里细胞增生、间质内大量炎性细胞浸润，以及微血管新生及软骨和骨组织破坏等。OC的形成、分化及活化会加重RA对骨破坏的程度，如果出现OC将会出现骨破坏的病变。

雷公藤，又名黄藤，首次记载于《神农本草经》，具有祛风通络、消肿止痛、清热解毒等功效，对炎症和自身性免疫疾病具有显著疗效。RA在中医学中属于“痹症”范畴，在《滇南本草》中已经有雷公藤治疗RA的记载，TP可有效抑制RA发病过程中促炎因子的异常升高及炎症递质的上调。研究结果显示，TP能改善RA大鼠关节肿胀，并减轻大鼠关节组织的炎症反应。TP还能抑制RA炎症反应和骨破坏。本实验研究结果表明，TP处理RA－OC后，细胞存活率及炎症因子TNF－α、IL－6表达水平降低，细胞凋亡率增加，提示TP可明显抑制RA－OC增殖和炎症反应，并促进其凋亡。

OC是体内唯一具有骨吸收功能的细胞，若其功能改变可导致骨质吸收异常。已经有研究结果发现，TP不僅对单独培养的OC分化及骨吸收功能具有抑制作用，并且对Tregs－OC共培养体系中OC的分化及骨吸收功能也有明显的抑制作用。标志性因子抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、组织蛋白酶K（Ctsk）、CTR、MMP－9等是一系列与OC吸收有关的酶。TRAP参与了OC介导的骨转换过程，而Ctsk可以影响OC中TRAP的运输。MMP－9是降解OC外基质、参与骨重建的重要蛋白酶，在增强OC的骨吸收中起重要作用。已经有研究表明，高迁移率族蛋白1诱导的OC中TRAP活性显著升高，而TP可以降低其活性。本实验研究结果也显示，TP处理RA－OC后可以降低Trap、Ctsk、CTR、MMP－9 mRNA表达。活化T细胞核因子（NFATc1）在OC中发挥着重要的转录调节作用，c－Fos和c－Jun与NFATc1结合可组成一个转录调节复合体。本实验研究显示，TP可显著降低RA－OC的NFATc1、c－Fos、c－Jun mRNA和蛋白表达，提示TP可抑制RA－OC分化。

NF－κB具有介导免疫应答的生理功能，炎症反应的发生与NF－κB信号通路激活有关，NF－κB在炎性因子的诱导等多种细胞生物学过程中发挥重要功能。NF－κB信号通路参与了机体RA的调节机制，药物干预可以抑制该通路的活性，从而达到治愈疾病的目的。有研究表明，TP能通过NF－κB信号通路抑制血管内皮细胞的炎性损伤。NF－κB信号通路激活能抑制RA－OC分化及骨吸收。本实验研究结果显示，TP可降低RA－OC中p－IκB蛋白表达，提示TP可能通过NF－κB信号通路影响RA的发展。

综上所述，TP通过抑制NF－κB信号通路减轻RA－OC分化，抑制细胞增殖和炎症反应，并诱导细胞凋亡，这为治疗RA提供了理论基础。但是，本研究也存在一些局限性，比如没有采用NF－κB的激动剂进行TP作用的复验证，没有建立小鼠模型进行体内实验验证。今后，我们将进行这些研究进一步验证本文的结论。

［参考文献］

穆培霞，马玲，付冬冬，等. 艾拉莫德对类风湿关节炎滑膜细胞凋亡及炎症因子水平的影响.  郑州大学学报（医学版）， 2020，55（3）：364－368.

宣依依，杨晶，向勇，等. 类风湿关节炎小剂量甲氨蝶呤治疗药物监测及基因多态性研究进展.  郑州大学学报（医学版）， 2019，54（4）：538－542.

JARRAR H， ALTINDAL D ， GM DERELIOLU M. Effect of melatonin/BMP－2 co－delivery scaffolds on the osteoclast activity.  Journal of Materials Science： Materials in Medicine， 2021，32（4）：32.

YANG J C， WANG S H， ZHANG G J， et al. Static magnetic field （2－4 T） improves bone microstructure and mechanical properties by coordinating osteoblast/osteoclast differentiation in mice.  Bioelectromagnetics， 2021，42（3）：200－211.

徐子涵，蔡佳宇，李婧，等. 姜黃素对类风湿关节炎破骨细胞分化中核因子κB受体活化因子基因及蛋白表达的影响.  安徽医药， 2019，23（10）：1917－1920，2121.

FU J M， ZANG Y D， ZHOU Y， et al. Exploring a novel triptolide derivative possess anti－colitis effect via regulating T cell differentiation.  International Immunopharmacology， 2021，94：107472.

LI F Q， CUI H Z， JIN X， et al. Triptolide inhibits epithelial－mesenchymal transition and induces apoptosis in gefitinib－resistant lung cancer cells.  Oncology Reports， 2020，43（5）：1569－1579.

冯悦，钟萌，罗见春，等. 18F－FDG PET/CT技术监测雷公藤甲素对类风湿关节炎模型大鼠关节损伤的改善作用.  中国药房， 2018，29（22）：3059－3062.

ALETAHA D， NEOGI T， SILMAN A J， et al. 2010 Rheumatoid arthritis classification criteria： an American College of Rheumatology/European League Against Rheumatism colla－

borative initiative.  Arthritis and Rheumatism， 2010，62（9）：2569－2581.

蔡辉，徐子涵，商玮，等. 类风湿关节炎患者破骨细胞分化情况及其与骨破坏的关系.  中国免疫学杂志， 2019，35（5）：604－607.

PAN T， CHENG T F， JIA Y R， et al. Anti－rheumatoid arthritis effects of traditional Chinese herb couple in adjuvant－induced arthritis in rats.  Journal of Ethnopharmacology， 2017，205：1－7.

SATO K， TAKAYANAGI H. Osteoclasts， rheumatoid arthritis， and osteoimmunology.  Current Opinion in Rheumatology， 2006，18（4）：419－426.

张诗雨，张静，高攀，等. 雷公藤甲素对血管内皮细胞炎症反应的影响及机制研究.  时珍国医国药， 2021，32（7）：1537－1541.

申巧燕，胡国红，陈妙娟，等. 雷公藤多苷片联合艾拉莫德对老年活动期类风湿关节炎患者的临床疗效.  中成药， 2021，43（2）：384－387.

邹燕，吴宪鸣，徐亚沛，等. 雷公藤甲素干预前后类风湿性关节炎患者炎症表达、关节肿胀疼痛度的变化.  国际医药卫生导报， 2016，22（12）：1687－1689.

范文强，吕书龙，马玲，等. 雷公藤甲素治疗类风湿关节炎的作用机制及安全性分析.  中草药， 2019，50（16）：3866－3871.

郭占非，齐路霞，张超，等. 基于RANKL－RANK－OPG信号通路探讨雷公藤甲素对类风湿关节炎骨破坏的作用机制.  湖北民族大学学报（医学版）， 2021，38（4）：45－48，52.

KIM J M， LIN C J， STAVRE Z， et al. Osteoblast－osteoclast communication and bone homeostasis.  Cells， 2020，9（9）：2073.

郭占非，齐路霞，张超，等. 雷公藤甲素对类风湿关节炎骨破坏的抑制作用及对患者类风湿因子、APN水平的影响.  黑龙江医药科学， 2021，44（5）：62－63，65.

林紫微，杨菲，黄天一，等. 芍药苷干预成骨细胞凋亡抗骨质疏松作用研究.  南京中医药大学学报， 2019，35（4）：426－431.

冯佳，龚书识，夏燕，等. 艾拉莫德对类风湿关节炎外周血破骨细胞分化及破骨细胞相关基因表达的影响.  中国骨质疏松杂志， 2019，25（1）：97－102.

王贵，郭明慧，徐慧慧，等. 雷公藤甲素对高迁移率族蛋白1诱导的破骨细胞分化的影响. 中日友好医院学报， 2017，31（2）：102－106，130.

李忠浩，丁宁，杨全增，等. 破骨细胞中NFATc1相关调节研究进展.  中国骨质疏松杂志， 2017，23（5）：695－700.

邓丽，文振华，田锋，等. 艾拉莫德通过TLR4/NF－κB通路抑制骨关节炎软骨细胞模型凋亡及炎症反应.  国际检验医学杂志， 2023，44（3）：316－321.

万海山，代伟宏，黄泽晓，等. 蒲公英甾醇对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的增殖、迁移和凋亡及TLR4/NF－κB信号通路的影响.  医学研究杂志， 2020，49（11）：126－131.

邓杰忠，杨宇生，何晋月，等. 1，25（OH）2D3通过抑制IκB/NF－κB信号通路抑制破骨细胞生成.  第三军医大学学报， 2021，43（14）：1339－1345.

（本文编辑 于国艺）