养正消积胶囊通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导肺腺癌细胞凋亡和自噬的作用研究

周菁,王玉珍,李丽娜,郭亚焕,史玉民,焦咪,段炼,阎丽,王佳

(1.陕西省肿瘤医院肿瘤内科;2.空军军医大学附属西京医院泌尿外科,陕西 西安 710000)

肺癌具有高发病率和高死亡率,主要有非小细胞癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞癌两种类型,以NSCLC最为常见[1]。NSCLC患者主要为肺腺癌,此类患者在疾病早期通常无典型表现,但具有高转移潜能。调查[2]发现,在确诊为肺腺癌患者中,70%的患者已进展为中晚期,错失最佳治疗时机。通过手术、放疗、化疗、靶向、免疫等手段的应用,晚期患者生存率提高有限[3-4]。临床研究[5]已证实,中医在恶性肿瘤的临床治疗中具有安全性高、药物副作用小等突出优势。养正消积胶囊是一种由16味中药组方构成的方剂,可从多种途径诱导肿瘤的凋亡和自噬,进而抑制肿瘤的进展[6]。研究[7-8]发现,PI3K/AKT/mTOR信号通路是调控细胞增殖、凋亡的重要通路。本课题组通过网络药理学相关数据库应用,发现养正消积胶囊可能是通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制肺腺癌的发展,故对肺腺癌A549细胞进行探究。

1 材料与方法

1.1 材料

人肺腺癌A549细胞(中国科学院细胞库),取对数生长期细胞用于实验。养正消积胶囊购自石家庄以岭药业股份有限公司。高糖DMEM培养基(美国Gibco公司);胎牛血清(上海源叶生物科技有限公司);β-actin单克隆抗体(美国Abcam公司);p-AKT、p-PI3K、p-mTOR、Beclin-1、LC3Ⅰ、ILC3Ⅱ单PI3K、AKT、mTOR、克隆抗体(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.2 主要仪器

CyFlowCounter型流式细胞仪(德国Partec公司)、5427R型低温高速离心机(德国Eppendrof公司)、HF240型细胞培养箱(上海力申科学仪器公司)、TE22型转膜仪、SE300型电泳仪(均购于美国Hoefer公司)、SpectramaxM3型多功能酶标仪(美国BioTek公司)、Mini-PROTEANTetra System型垂直电泳槽(美国Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 养正消积胶囊化学成分及靶点预测 中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)中分别输入养正消积胶囊的主要成分黄芪、莪术、白花蛇舌草、半枝莲进行检索并整理,获得活性化合物和作用靶点,使用R语言将与药物活性成分相关的靶点和疾病靶点进行匹配映射,且绘制韦恩图(Venn),将获得的潜在抗肺腺癌的作用靶点,构建养正消积胶囊靶点蛋白相互作用网络,进行KEGG通路分析和基因本体(GO)富集分析。

1.3.2 养正消积胶囊提取物制备 将养正消积配方粉添加至纯DMSO溶液中,并在4 ℃条件下静置12 h,离心机100 r/min离心20 min后过滤上清液。用平衡盐溶液稀释提取物,使用分光光度计在波长405 nm波长下进行光密度定量化,以透光度0.25的溶液作为标准实验用药,将养正消积胶囊提取物命名为DME25用于后续实验。

1.3.3 细胞培养及分组 将DMEM(含有浓度为10%的胎牛血清、浓度为1%双抗)培养基于培养箱(37 ℃、5% CO2)中对人肺腺癌A549细胞进行培养,观察每日的生长情况。依据不同浓度将细胞分为空白对照组、DME25高(1∶200)、中(1∶1 000)、低(1∶5 000)浓度组。

1.3.4 CCK-8法测定DME25对人肺腺癌A549细胞增殖能力 将A549细胞(1×104个细胞/孔)接种到96孔板中,然后用不同浓度的DME25(1∶200、1∶1 000、1∶5 000)处理48 h。将10 μL CCK-8溶液添加到96孔板中。温育3 h后,采用酶标仪检测细胞吸光度值。

1.3.5 细胞划痕实验 将浓度为1×105个/mL的A549细胞接种至12孔板。细胞贴壁后,10 μL枪头垂直于培养板背面划痕,PBS清洗3次,将细胞随机分为4组:对照组、DME25低、中、高浓度组,给予对应浓度药液处理后继续培养,分别于0、12、24 h时拍照观察。并绘制24 h时各组细胞迁移距离的柱状图。实验至少重复3次。

1.3.6 Transwell侵袭实验 将100 μL Matrigel用DMEM培养基稀释后,加入Transwell上室。取不同浓度DME25干预24 h的对数生长期A549细胞,消化后放入不含胎牛血清的DMEM培养液中。将细胞浓度调整为5×104个/mL的细胞接种至Transwell上室,混有血清和细胞的培养基缓慢加入下室。在37 ℃、5% CO2小室内培养24 h后取出,细棉签轻擦小室内部未穿膜的细胞,固定20 min(固定物:4%多聚甲醛),染色20 min(染色物:结晶紫),显微镜下拍照计数。

1.3.7 流式细胞术检测A549细胞凋亡率 将对数生长过程的A549细胞,按照每个孔4×105/个接种于6孔板内。在37 ℃的培养环境下培养24 h,待细胞贴壁生长后,向实验组中加入提前配好的不同浓度DME25溶液,置于培养箱中培养48 h。收集上述处理后的细胞,用提前预冷的无菌PBS溶液洗涤后加入1×Binding缓冲液100 μL,随后加入Annexin V-FITC溶液和碘化丙啶溶液各5 μL。细胞放置在避光黑暗处,轻轻震荡10 min后加1×Binding缓冲液400 μL摇匀,上机检测细胞凋亡率。

1.3.8 Western blot检测PI3K激活剂对各组细胞中PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ表达的影响 在6孔板内接种将密度为5×105个/mL的A549细胞,贴壁生长融合≥75%时,将浓度相当的DME25干预细胞加入,在培养箱(37 ℃、5%CO2)中培养48 h后收集细胞。各组细胞总蛋白的提取使用蛋白提取试剂盒,BCA试剂盒检测蛋白浓度。100 ℃下将混合均匀蛋白样品液与缓冲液变性5 min,进行SDS-PAGE分离蛋白、转膜、封闭,加一抗(1∶1 000稀释的PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1抗体与β-actin抗体),于4 ℃孵育过夜,将二抗加至洗涤后的TBST,室温避光孵育2 h,TBST洗膜、显影,显影设备为化学发光显影试剂盒,β-actin为内参,分析DME25对上述蛋白表达水平的影响。此后将细胞分为两组,一组加中浓度DME25干预,一组加入PI3K激活剂740Y-P干预,置于培养箱(37 ℃、5%CO2)培养48 h后收集提取蛋白,Western blot法检测各组细胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ蛋白的表达。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 运用网络药理学相关数据库研究养正消积胶囊治疗肺腺癌的潜在作用靶点及机制

通过TCMSP平台数据库的检索养正消积胶囊组份中重要的4种中药,其中黄芪化学成分87个,莪术81个,半枝莲94个,白花舌蛇草37个。通过OB>30%和DL>0.18筛选得到这4种药物的潜在活性成分莪术3个,黄芪18个,白花舌蛇草7个,半枝莲26个。

采用Genecard、GAD和Omim数据库平台,检索关键词“lung adenocarcinoma”,共得到肺腺癌的潜在作用靶点8 685个,靶基因中归属于黄芪的152个,莪术9个,白花舌蛇草135个,半枝莲164个,与肺腺癌基因取交集后共同靶点为8个。将黄芪-莪术-白花舌蛇草-半枝莲与肺腺癌相关的关键靶点基因导入Cytoscape软件,进行网络构建及可视化,得到养正消积胶囊治疗肺腺癌的有效活性成分。将黄芪-莪术-白花舌蛇草-半枝莲治疗肺腺癌的潜在的关键靶基因导入String数据库平台,获取各蛋白质之间的关系,采用该平台绘制蛋白关系网络,根据Degre≥24的节点制作出前20个关键蛋白质节点分别为MAPK1、TP53、JUN、AKT1、TNF、RELA、HSP90AA1、ESR1、MAPK14、FOS、IL6、RXRA、MAPK8、EGFR、CCND1、RB1、CXCL8、PRKCA、CDKN1A、MYC。后续的GO富集分析结果显示,养正消积胶囊与肺腺癌相关的关键生物学功能主要为细胞对化学应激的反应、对氧化应激的反应、对药物的反应、对凋亡信号通路的负向调节、对缺氧的反应、凋亡信号通路的负调控、凋亡信号通路的调控等。KEGG通路富集分析显示相关靶点主要富集的通路为脂质与动脉粥样硬化、PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、癌症中的蛋白糖、IL-17信号通路、TNF信号通路等,提示上述通路可作为研究养正消积胶囊抗肺腺癌疗效的重要方向。见图1。

2.2 CCK-8法测定DME25对人肺腺癌A549细胞增殖的影响

与对照组相比,低、中、高浓度DME25处理的A549细胞增殖能力下降,浓度越高细胞增殖能力越弱,且不同浓度组间细胞增殖能力比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2。

2.3 DME25对人肺腺癌A549细胞迁移和侵袭能力的影响

DME25处理后,细胞迁移、侵袭能力较对照组弱,且高浓度组<中浓度组<低浓度组<对照组(P<0.05)。见图3及图4。

2.4 DME25对人肺腺癌A549细胞凋亡的影响

与对照组相比,DME25低、中及高浓度组中A549细胞的凋亡率均增高(P<0.05),且浓度越高,凋亡率越高。见图5。

2.5 DME25对人肺腺癌A549细胞自噬的影响

Western blot结果显示,A549细胞经DME25干预24 h后,自噬标志蛋白LC3-Ⅱ的表达水平升高,同时促进LC3Ⅰ向ILC3Ⅱ转化,且Beclin-1蛋白水平也升高(P<0.05)。见图6。

2.6 DME25对PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达水平的影响

与对照组相比,经DME25干预对数生长期的A549细胞24 h后,DME25能降低p-P13K、p-mTOR和p-AKT蛋白的水平(P<0.05),而DME25对P13K、AKT、mTOR蛋白的表达无影响。见图7。

2.7 PI3K激活剂740Y-P对PI3K/AKT/mTOR信号通路及自噬相关蛋白表达水平的影响

与对照组相比,加入50 μg/mL 浓度的740Y-P(PI3K激活剂)培养8 h后,p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达均增多,Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3Ⅱ表达减少、LC3Ⅰ比值均降低(P<0.05)。见图8。

3 讨论

养正消积胶囊是一种由黄芪、莪术、白花舌蛇草、半枝莲等16味中药材共同组成的中药补益剂,具有扶正祛邪、解毒化瘀及健脾益肾等功效,对多种恶性肿瘤均具有良好的治疗效果[9-10]。养正消积胶囊的药理作用机制研究[11]显示,该药可通过作用于FAK、PI3K/Akt、HSP27及其受体c MET等来起到抑制肿瘤进展的作用。一项纳入11项研究的meta分析报告[12]显示,与单纯化疗相比,养正消积胶囊与化疗联合治疗非小细胞肺癌效果更优,且可减轻化疗毒副反应。陈晓萌等[13]研究也证实了养正消积胶囊对原发性肝癌具有明确的治疗效果,且安全性较高。研究[14]发现,当细胞的凋亡受到抑制时,便会导致肿瘤的发生和进展。本研究发现,养正消积胶囊中四种中药黄芪、莪术、白花舌蛇草、半枝莲与肺腺癌密切相关的有效化合物槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、汉黄芩素等,通过MAPK1、TP53、JUN、AKT1、TNF、RELA、HSP90AA1、ESR1、MAPK14等基因,影响细胞对化学应激的反应、对氧化应激的反应、对药物的反应、对凋亡信号通路的负向调节,可能是通过流体剪切应力、脂质与动脉粥样硬化、PI3K-Akt及MAPK信号通路、癌症中的蛋白糖、IL-17及TNF等信号通路发挥作用。进而制备养正消积胶囊的提取物加入肺腺癌A549细胞后,通过表型实验发现,与对照组相比,DME25可降低A549细胞的增殖及迁移侵袭能力,提高细胞凋亡率,提示DME25对肺腺癌具有明确的治疗效果。

细胞自噬指的是通过基因调控细胞自行结束生命的行为,与细胞稳态、发育及免疫反应等多个生物学过程相关,是目前新发现的癌症治疗靶点。LC3为细胞自噬活性的标志性蛋白,其亚型有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。在自噬发生时,LC3-Ⅰ可转化为LC3-Ⅱ,故可通过LC3-Ⅱ/LC3-1值的高低来评估细胞的自噬水平[15]。现已证实[16],自噬相关基因Beclinl主要诱导自噬的启动,是调节细胞正向自噬的最重要因子。研究显示,A549细胞经DME25干预24 h后,自噬标志蛋白LC3-Ⅱ的表达水平升高,同时促进LC3Ⅰ向ILC3Ⅱ转化,即ILC3Ⅱ/LC3Ⅰ升高,且Beclin-1蛋白水平也升高,提示养正消积胶囊可对肿瘤细胞的自噬过程也有着一定的促进作用。

PI3K/Akt/mTOR 信号通路是对肿瘤细胞增殖、凋亡等生物学行为均有一定调节作用的信号通路。王军等[17]研究亦证实,抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路可促进人结肠癌SW480细胞的凋亡和自噬。本研究显示,经DME25干预的各组A549细胞中的p-PI3K、p-Akt及p-mTOR蛋白含量均低于对照组,Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值亦低于对照组,且呈剂量依赖性,提示DME25可能是通过下调A549细胞中PI3K、AKT磷酸化水平,促进细胞自噬,进而抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路的促癌作用。

综上,养正消积胶囊养通过下调肺腺癌A549细胞中PI3K、AKT、mTOR磷酸化水平,促进细胞自噬,抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路的促癌作用。