SiO2纳米颗粒对猪粪好氧堆肥过程中重金属形态分布和细菌群落的影响

2023-06-26江海鸿王小娟宋籽霖丁庆玲魏淑梅周志鹏李悦瑄

西北农业学报 2023年7期

江海鸿,王小娟,谷洁,宋籽霖,丁庆玲,魏淑梅,周志鹏,李悦瑄,魏媛

(西北农林科技大学资源环境学院,陕西杨凌 712100)

随着畜禽养殖业逐步趋向于集约化、规模化和专业化的发展,从而产生了大量的畜禽粪便。据统计,中国每年畜禽粪便产生量高达38亿 t,但综合利用率却不足60%[1]。重金属铜和锌由于具有预防动物疾病和促进动物生长的作用,常被用作饲料添加剂[2-3]。但这些重金属不能被动物完全吸收利用且化学性质稳定,大部分未被利用的重金属会随粪便排出体外[4]。畜禽粪便中重金属的残留成为限制畜禽粪便回收利用的瓶颈。

好氧堆肥是常用的畜禽粪便无害化处理和资源化利用的方法之一,堆肥不会降低重金属总量,有机肥的农业应用会导致重金属在土壤中的积累。但是重金属的环境特征,包括生物利用度、毒性和流动性是由重金属的形态决定的。堆肥能通过调节重金属在不同形态进行转化从而降低重金属的毒性[5]。堆肥的本质是通过微生物的作用将大分子有机物降解为腐殖质的过程。以往的研究表明,重金属的钝化效果与微生物活性密切相关。微生物可以通过生物吸附直接钝化重金属[6],或通过表达一系列的重金属抗性蛋白(例如金属结合蛋白、金属氧化酶、金属还原酶)来降低重金属的有效性[7-8]。微生物还可以通过纤维素酶和木质素酶基因的表达来调节有机物的降解和腐殖质的生成,从而通过腐殖质与重金属阳离子的络合间接影响重金属的生物有效性[9]。重金属的生物有效性与微生物之间的关系常因物种不同而具有差异。例如,Cu和Zn的生物有效性分别与热脱球菌(Deinococcus-Thermus)和变形菌(Proteobacteria)的丰度具有最高的相关性[10]。Hao等[11]将重金属组分与细菌丰度之间做了Pearson相关性分析,结果表明Cu与更多的细菌显著相关,而Zn与细菌的相关性较少。在堆肥过程中,温度、pH、电导率(EC)、总碳和总氮可以调节微生物的活性,从而通过直接和间接作用进一步影响重金属的生物有效性[10]。此外,理化性质对重金属也具有钝化作用。pH的增加能使酸溶性组分形成沉淀来降低重金属的迁移率[12]。有机物与带负电荷的重金属界面结合形成稳定的配合物来影响重金属组分的变化[13-14],特别是富含羧基和羟基的腐殖物质更易与金属形成稳定的配合物[15]。

仅依靠堆肥降低重金属的生物有效性是有限的,添加剂的使用能有效提高重金属的钝化效果。Awasthi等[16]的研究表明生物炭有效降低了污泥堆肥中重金属Cu、Zn、Pb和Ni的生物有效性。其他添加剂包括石灰[17]、沸石[18]、麦饭石[19]和磷岩[20]都被用于堆肥以促进重金属的可移动部分转化为稳定部分。添加剂通过与重金属离子直接结合,或通过调节碳、氮和磷转化等过程,改善微生物群落结构,从而通过吸附、络合/沉淀/离子交换和微生物富集/代谢机制降低重金属的毒性。SiO2纳米颗粒(SiO2NPs)是无污染的非金属颗粒,具有较大的比表面积和稳定的化学性质,可从各种类型的农业废物中合成[21],广泛用于去除水和土壤中的重金属[22-23]。因此,笔者推测在堆肥过程中加入SiO2NPs有助于重金属生物利用度的降低。

本试验以猪粪和小麦秸秆为堆肥原料,SiO2NPs为添加剂。(1)研究SiO2NPs对重金属Cu和Zn形态分布的影响;(2)分析SiO2NPs对堆肥过程中细菌变化的影响;(3)研究细菌群落、环境因素与重金属之间的相互作用。这些结果有助于了解堆肥过程中重金属钝化途径的理论体系,提供一种利用SiO2NPs来降低堆肥过程中重金属生物有效性的方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

原料为猪粪和麦秸,猪粪采自杨凌某中型养殖场,小麦秸秆采自西北农林科技大学某试验田。猪粪和小麦秸秆的基本性质见表1。SiO2NPs从北京德科岛津纳米科技有限公司购买,其平均粒径为30 nm,比表面积为200 m2/g。

表1 堆肥材料的基本性质Table 1 Property of compost raw materials

堆肥试验在密封反应器(有效容积为75 L)进行。为保证堆肥过程中氧含量充足,在整个堆肥过程中,堆肥底部以0.35 L/(h·kg)(干质量)的通风速率进行通风。将猪粪和秸秆混合,调节初始C/N比为30∶1,含水率约为60%。根据前人的研究和SiO2NPs的特性[24-25],按照湿质量向混合物中分别添加0、0.5 g/kg、1 g/kg和2 g/kg的SiO2NPs,记作CK、L、M和H。每个处理设置3个重复,堆肥过程共进行40 d。

1.2 样品采集与制备

根据堆体温度的变化,重复堆肥样品分别在堆肥初期(第0天)、中温期(第1天)、高温期(第11天)、降温期(第16天)和成熟期(第40天)进行采集。将重复样品混合均匀后分为两部分:一部分保存于4 ℃,用于理化分析;另一部分保存于-80 ℃,用于DNA提取和微生物测序。

1.3 分析方法

1.3.1 腐熟度指标的测定每天测量堆芯和环境温度。用pH计(PHS-3C,LeiCi,中国)测定pH。电导率用电导率仪(DDS-307 电导率仪)测定。使用元素分析仪(Vario Macro Cube,Elementar,德国)测定总碳和总氮含量。种子发芽指数(GI)的测定参照NY/T3442-2019标准进行,计算公式:

1.3.2 重金属Cu、Zn总量和形态的测定采用HNO3-HCl-HF-H2O2微波消解法测定堆肥样品中重金属Cu和Zn的总量。重金属Cu和Zn的形态采用BCR连续提取法进行测定[26],包括可交换态(F1)、可还原态(F2)、可氧化态(F3)和残渣态(F4)。使用火焰原子吸收光谱仪(PE 900F,美国)测定重金属Cu和Zn总量及各形态的含量。

重金属的生物利用度=可交换态重金属含量+可还原态重金属含量

重金属的钝化率=(堆肥前重金属的生物利用度-堆肥后重金属的利用度)/堆肥前重金属的生物利用度×100%

1.3.3 堆肥样品DNA的提取及测序根据制造商的说明,使用Fast DNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedical, USA)提取堆肥样品的DNA。提取的DNA在Illumina HiSeq平台(上海,中国)上进行测序。采用引物338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)扩增16S rRNA基因的V3～V4区域。QIIME(版本 1.9.1)和FLASH (版本1.2.1)用于原始序列的质量筛选。使用UPARSE(版本7.0.1090)在97%的序列相似性水平上检测操作分类单元(OTU),使用RDP分类器对OTU进行分类。

1.4 数据统计及分析

采用SPSS 19.0对数据进行LSD差异性检验。采用Excel 2019对腐熟度指标和重金属进行绘图分析。使用Origin和HemI V 1.0绘制细菌丰度图。使用R V 4.1.0对重金属生物利用度与细菌之间的关系以及影响重金属生物利用度的因素进行可视化分析。

2 结果与分析

2.1 SiO2NPs对腐熟度指标的影响

2.1.1 对温度的影响堆体温度是整个堆肥过程的关键因素之一,也是表征堆肥过程中微生物活性和堆肥腐熟度的重要指标[27]。如图1-a所示,在整个堆肥过程中,各处理的温度均呈现出前期大幅度升高后期下降并趋于平缓的变化趋势。CK、L、M和H处理分别在第4天、第4天、第2天和第1天进入高温期(≥50 ℃),随后温度峰值分别达到60.04 ℃、63.52 ℃、70.03 ℃和 70.08 ℃,高温维持时间分别为12 d、12 d、14 d和15 d,符合无害堆肥标准的要求(GB 7959-2012)。添加SiO2NPs缩短堆体进入高温期的时间,提高堆体的最高温度,延长高温期,更有助于堆肥腐熟。之后随着可生物降解有机物的分解,微生物活动逐渐减弱,堆体温度逐渐降低直至趋于环境温度水平。

图1 堆肥过程中温度、pH、电导率、总碳、总氮、C/N和发芽指数的变化Fig.1 Changes of temperature, pH, electrical conductivity, total carbon, total nitrogen, C/N, and germination index during composting

堆肥基质的盐度用电导率(EC)表示,EC也反映了堆肥产品的植物毒性[31]。如图1-c所示,4个处理的EC变化趋势相似,堆肥初期由于有机质的降解导致EC急剧下降。随着堆肥的进行,有机酸的溶解作用及氨气以铵盐形式存在等使电导率上升[32]。最终由于有机质含量降低和氨气挥发导致电导率降低。堆肥后,各处理的EC较堆肥前显著降低(P<0.05),分别为1.53、1.71、1.98和1.97 mS/cm,满足有机肥标准规定的小于3 mS/cm,添加SiO2NPs显著提高堆肥产品的EC(P<0.01)。

2.1.3 对总碳、总氮和C/N的影响微生物通过分解堆肥材料获得碳和氮等营养物质,以供给微生物的生长繁殖。碳和氮的含量是影响堆肥进程的主要指标之一,直接影响微生物活性[33]。从图1-d可以看出,堆料中的总碳含量持续下降,表明堆料中可降解有机物质不断被微生物消耗利用,碳素损失较快。在腐熟期,CK、L、M和H处理中的总碳含量由初始376.07 g/kg分别降至318.27、326.23、309.91和279.05 g/kg。M和H处理中碳素损失显著高于CK处理(P< 0.01),这可能是因为M和H处理中的微生物生长导致有效碳分解更快。

堆料中的总氮含量持续增加(图1-e),这可能是由于堆肥中固氮微生物的活性较高,固定了更多氮素[34]。此外,大量有机物以水蒸气、CO2等形式逸出造成堆体质量下降,形成“浓缩现象”[35]。当干物质的“浓缩效应”大于氮素的矿化作用时,就会导致总氮含量的增加。王佳等[36]利用厨余垃圾堆肥得到了类似的结果。堆肥结束时,CK、L、M和H处理中的总氮含量由初始 12.89 g/kg分别增加到28.20、27.71、28.68和31.33 g/kg。H处理的总氮含量显著高于CK处理(P<0.01),这可能是因为添加高剂量的SiO2NPs增强了氮素的固定从而减少了氨的剧烈挥发。

图1-f显示各处理在堆肥过程中C/N的变化。由图可知,各处理的C/N在堆肥过程中呈现逐渐降低的变化趋势,与于静等[37]的研究结果一致,这是由于堆肥过程中微生物对有机碳的消耗速率大于有机氮。堆肥结束时,CK、L、M和H处理的C/N值分别为11.28、11.77、10.80和 8.91,已满足堆肥腐熟要求(C/N<20)[38]。H处理的C/N下降幅度最大,且在堆肥的各个阶段均显著低于CK处理(P<0.01),表明高剂量的SiO2NPs促进了有机物的生物降解,有助于堆肥腐熟。

2.1.4 SiO2NPs对发芽指数(GI)的影响 GI广泛用于评估堆肥的植物毒性和腐熟度。当GI>50%时,认为堆肥材料的毒性相对较低;当GI>80%时,认为堆肥已腐熟或对植物无毒性[39]。如图1-g所示,4个处理的GI变化趋势相同,都是随着堆肥的进行呈现逐渐升高的趋势。当堆肥结束时,CK、L、M和H处理的GI分别为134%、163%、182%和167%,表明添加SiO2NPs可以显著提高GI(P<0.01),促进堆肥腐熟的程度。

2.2 SiO2NPs对重金属的影响

2.2.1 SiO2NPs对重金属总量的影响对堆肥不同阶段样品中重金属Cu和Zn的总量进行检测(图2-a)。4个处理Cu和Zn的总量随着堆肥进程逐渐升高,这是由于矿化过程中有机物分解和挥发性物质损失,使得堆体变小,导致堆体中Cu和Zn被“浓缩”[5]。堆肥结束时,Cu的含量表现为CK处理(100.75 mg/kg)

图2 堆肥过程中Cu、Zn总量(a)和形态分布(b、c)的变化以及堆肥后Cu、Zn在不同处理中的钝化率(d、e)Fig.2 Changes of total amount (a) and speciation distribution (b, c) of Cu and Zn during composting, the passivation rate (d, e) of Cu and Zn under different treatments after composting

2.2.2 SiO2NPs对重金属形态的影响如图2-b所示,在整个堆肥过程中,Cu的主要形态是可氧化态(F3)和残渣态(F4)。堆肥前,Cu的4种形态分别占总量的14.97%、24.08%、38.03%和22.92%。随着堆肥的进行,可交换态(F1)和可还原态(F2)的含量逐渐降低,最终F1在CK、L、M和H处理中降低为14.38%、10.20%、6.88%和5.08%,F2在CK、L、M和H处理中降低为 4.33%、3.43%、2.15%和1.21%。F3和F4的含量逐渐升高,在堆肥结束时分别增加为 56.58%～63.74%和24.71%～29.98%。这与刘秋萌[40]的研究结果类似,即钝化剂处理后F3分配率最大。F1和F2被认为是生物有效组分,容易被微生物吸收和利用[41]。堆肥结束时,CK、L、M和H处理对Cu的生物有效组分的相对钝化率分别为52.09%、65.10%、76.86%和 83.89%(图2-d)。基于上述结果,表明添加SiO2NPs显著提高Cu的钝化率(P<0.01),且随着剂量的增加钝化效果越好。

F1和F2是堆肥过程中Zn的主要存在形态,二者之和的占比为48.51%～72.94%(图2-c)。在堆肥原料中,Zn的F1是最重要的形态,占总量的44.69%。经过堆肥处理后,F1含量显著降低,最终在CK、L、M和H处理中降低为 37.75%、30.34%、25.52%和17.94%。堆肥结束时,F3含量在CK、L、M和H处理中升高为11.86%、13.88%、18.38%和30.38%。从Zn的生物有效组分的相对钝化率来看,H(27.93%)>M(9.55%)>L(6.62%)>CK(1.83%)(图2-e)。这些结果表明,添加SiO2NPs能显著降低Zn的生物有效组分(P<0.01),有利于Zn向着稳定态和生物有效性降低的方向转变。

2.3 SiO2NPs对细菌群落结构的影响

在好氧堆肥过程中,有机物通过微生物分泌酶的作用而分解。桑基图和热图共同说明在堆肥过程中细菌前35科的组成情况及相对丰度的变化(图3)。厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteriota)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidota)是优势菌门,在堆肥过程中占细菌总数的63.44%～99.75%,这与胡婷[42]的结果一致。在前35科中,有25.71%属于厚壁菌门,其次是细菌科属于放线菌门和变形菌门的较多,均占22.86%。这几个门的微生物在堆肥过程中对有机物的降解(包括碳水化合物和氨基酸)起主要作用[43]。

图3 堆肥过程中细菌前35科的变化Fig.3 Change of top 35 bacterial family during composting

乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、葡萄球菌科(Planococcaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)和黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)在堆肥原料中有较高的丰度(图3)。随着堆肥的进行,这些非嗜热细菌科的相对丰度显著降低。在堆肥的高温期,杆菌科(Bacillaceae)、拟杆菌科(Paenibacillaceae)、Limnochordaceae、拟诺卡菌科(Nocardiopsaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)、热微生物科(Thermomicrobiaceae)、Sandaracinaceae成为优势菌科,它们是嗜热菌科[44],对有机物的分解起着主要的作用。这些细菌科在L、M和H处理中的总丰度分别比CK高9.18%、13.48%和 14.74%(P<0.01),SiO2NPs的添加促进这些嗜热菌科丰度的增加。在添加SiO2NPs处理中,温度始终高于CK,这归因于这些嗜热菌科的大量增殖,能够充分利用复杂的有机物作为碳源从而分解有机物。Shannon、Simpson、Ace和Chao指数基于物种的丰富度和均匀度,用于反映物种多样性,其中Shannon、Ace和Chao指数越大,代表物种的丰富度和多样性越高,而Simpson指数相反。堆肥后细菌的Shannon、Ace和Chao指数分别显著升高74.57%～94.67%、35.50%～ 61.18%和26.77%～64.79%,Simpson指数显著降低74.81%～89.96%(表2),表明堆肥后细菌群落的多样性和丰富度显著增加,其中SiO2NPs处理的增幅最大,表明添加SiO2NPs有利于丰富堆肥过程中的细菌群落。

表2 细菌群落的多样性Table 2 Diversity of bacterial community

2.4 细菌群落与重金属生物有效性的关系

选取细菌前35科的相对丰度,分析其与Cu、Zn的可交换态(F1)和可还原态(F2)的关系,如图4所示。Zn与细菌科的相关性最为显著,共有27条正相关关系,其中Zn-F1主要与Proteobacteria正相关,Zn-F2主要与Actinobacteria正相关。然而,Cu的生物有效性与细菌科的相关性较少。Cu-F2与链球菌科(Streptococcaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)和球菌科(Planococcaceae)呈正相关,Cu-F1仅与伪诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)和贝耶林奇菌科(Beijerinckiaceae)正相关。微生物对重金属的钝化具有直接和间接的影响。例如,主要由肽聚糖和磷壁酸组成细胞壁的以厚壁菌门为代表的革兰氏阳性细菌,它们的表面带负电,可通过静电吸附直接捕获电子[45]。这可能是Cu-F2含量大幅度降低的主要原因。此外,厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门能将纤维素降解为负价脂肪酸,从而与重金属阳离子结合形成稳定的化合物[10]。这些微生物会通过影响有机质的组成和官能团,从而通过络合作用影响重金属的生物有效性[46]。

图4 重金属生物有效组分与细菌(细菌前35科)之间的关系Fig.4 Relationship between bioavailable components of heavy metals and bacteria (top 35 bacterial family)

2.5 细菌群落和环境因素对重金属钝化途径的交互作用

选取细菌科的相对丰度和几个对细菌有显著影响的环境因子构建Cu、Zn的可交换态和可还原态的偏最小二乘路径模型(partial least squares-path model, PLS-PM)。Cu-F1主要受细菌(路径系数b=0.82)和C/N(b=0.53)的直接影响(图5-a),Cu-F2直接受电导率(b= -0.24)、细菌(b= -0.48)和C/N(b=0.50)的影响(图5-b)。Hao等[11]研究表明,微生物多样性的增加有助于重金属在不同形态间进行转化。具有铜抗性基因(例如copC)的微生物可以通过金属结合蛋白的诱导反应和反馈表达影响Cu的生物有效性[47]。另外,微生物群落演替受环境因子包括pH和C/N的调控[48]。对于Zn而言,直接受到细菌(b=1.12)和温度(b= -0.54)的影响,C/N对Zn具有间接影响(图5-c和5-d)。细菌可能通过调控纤维素的降解影响腐殖质的形成及其与锌的络合作用。此外,堆肥过程中,有机质的降解以及pH的升高会促进锌的吸附、沉淀和络合[49],从而降低Zn的生物有效性。图5反映出影响Cu的生物有效性的因子比Zn多,这可能解释了在堆肥系统中Cu比Zn更容易钝化。总体而言,细菌的直接作用和环境因子的直接/间接作用共同构成了钝化重金属的关键。