长春市2016—2020监测年度甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因特征分析

崔 薇,初 秋,李晨光,龚云伟,赵春艳,孙 宇,隋天卓,孙炳欣*

(1.长春市疾病预防控制中心,吉林 长春130033;2.吉林大学基础医学院,吉林 长春130021)

流感病毒是有包膜的负链RNA病毒,其中甲型流感整个基因组分成8个节段,分别编码PB2,PB1,PA,HA,NP,NA,M,NS等蛋白,每种蛋白在流感病毒感染、增殖、释放、扩散及传播过程中都行使不同的功能。其中血凝素(HA),它在流感病毒受体识别和入侵过程中起着重要的作用,同时能诱导机体产生中和抗体[1]。HA还是流感病毒容易发生变异的抗原,进而导致流感逃避宿主的免疫的识别与清除,从而引起流感的反复流行,因此对流感病毒抗原进化和疫苗选择的研究也主要集中在HA重要的氨基酸位点上。

为了解长春市甲型H1N1血凝素(HA)基因特征,我们对2016-2020年度甲型H1N1血凝素(HA)变异情况及进化特征进行了分析,为长春市甲型H1N1流感防控及预测提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源

按照《全国流感监测方案(2017版)》要求,长春市3家流感监测哨点医院对发热3天内流感样病例(体温≥38℃,伴咳嗽或咽痛之一)进行标本采集。长春市CDC流感网络实验室对这些流感样病例标本进行核酸检测,并对其中流感病毒阳性标本进行病毒分离,获得流感病毒毒株。本次研究选取长春市2016-2020年期间共4个监测年度的流感毒株109株,所有毒株均由长春CDC流感网络实验室分离鉴定。

1.2 甲型H1N1流感病毒毒株核酸提取和HA基因扩增

用硕世病毒核酸快速提取试剂盒提取流感病毒毒株RNA,将提取到的病毒RNA先反转录成cDNA,再用设计的引物进行血凝素(HA)基因扩增,对PCR产物用毛细管电泳方法进行确认。

1.3 甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因序列测定及分析

血凝素(HA)基因PCR产物送至上海生工生物工程公司进行基因测序和拼接。拼接后的序列经NCBI中的GenBank数据库Blast比对确认为甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因序列。选取WHO推荐2010-2017年疫苗株A/California/07/2009、2017-2019年北半球疫苗株A/Michigan/45/2015、2019-2020年北半球疫苗株A/Brisbane/02/2018、2020-2021年北半球疫苗株A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019(H1N1)、国内代表株A/Shanghai-Jiading/SWL1970/2015,国内分离的第1株甲型H1N1流感毒株A/Sichuan/1/2009(H1N1)作为参考序列,参考序列均来自GISAID网站。使用MegAlign软件进行HA基因核苷酸和氨基酸序列同源性分析,使用Mega7.0软件进行重要位点氨基酸突变分析。

2 结果

2.1 流感病毒流行情况及分析

2016年4月至2020年3月,长春地区共检测流感样病例样本7930份,其中流感病毒核酸阳性样本1061份,阳性率为13.38%。阳性样本中甲型H1N1流感病毒阳性样本475份,季节性H3N2流感病毒阳性样本356份,乙型流感病毒阳性样本230份。

从病原上分析,长春地区流感病毒在不同年份出现不同的优势株：2016年4月以甲型H1N1和B型流感病毒共同流行,随后的5-7月份甲型H1N1淡出,仅有B型流感病毒检出;2016年8月至9月期间未有流感病毒阳性检出;2016年10月至11月,仅零星有季节性H3N2流感病毒检出。2016年12月至2017年3月期间,呈现季节性H3N2和甲型H1N1流感病毒共同流行的局面,并且甲型H1N1流感病毒逐渐成为主导的流行亚型;到2017年4月至6月期间,甲型H1N1流感成为唯一的流行株;而在2017年7月至11月期间,主要以季节性H3N2流行为主,偶尔会检出甲型H1N1流感病毒。到了2017年12月至2月期间,又出现B型、季节性H3N2和甲型H1N1共同流行的局面,2018年3月到5月季节性H3N2流感病毒零检出,出现甲型H1N1和B型流感病毒共同流行的局面;2018年6月至11月未有流感病毒阳性检出。2018年12月至2019年1月主要以甲型H1N1流感流行为主,偶尔会检出B型流感病毒。到2019年2月至4月期间,又出现B型、季节性H3N2和甲型H1N1共同流行的局面,并且B型流感病毒逐渐成为主导的流感亚型,至2019年5月,仅有B型流感病毒阳性检出;2019年6月至9月未有流感病毒阳性检出;2019年10月至12月,主要以季节性H3N2为流行优势株,偶尔有甲型H1N1检出。而至2020年1月至3月,则为季节性H3N2和甲型H1N1共同流行,偶尔有B型流感病毒检出,见图1。

图1 2016—2020监测年度长春市流感病毒各亚型流行情况

在此期间,每年都有甲型H1N1流感病毒检出,特别是2017年1月至2017年6月,2018年12月至2019年2月,2020年1月至2020年2月这三个时间范围,甲型H1N1流感阳性样本分别占同时间范围阳性总数的70.27%(156/222),96.80%(212/219)和47.57%(49/103),甲型H1N1流感为流感流行的优势株。

2.2 HA基因进化分析

甲型H1N1流感病毒HA基因系统进化分析显示,长春地区2016—2020年4个监测年度甲型H1N1流行株的HA基因,均属于6B.1大分支,与疫苗株A/California/7/2009相比,其HA蛋白存在S84N、S162N和I216T共同的变异位点。甲型H1N1流感病毒毒株HA基因之间核苷酸同源性在96.9%～100%之间,氨基酸同源性在97.2%～100%之间。

其中2016—2017 年甲型H1N1流行株,与疫苗株A/California/7/2009相比,HA蛋白有P83S、S84N、D97N、S162N、K163Q、S185T、S203T、I216T、A256T、K283E、E374K、S451N、E499K共同的位点突变,与同一时期推荐的疫苗株A/California/7/2009 核苷酸同源性在97.0%～97.4%之间,氨基酸同源性在96.8% ～97.5%之间。

2017—2018 年甲型H1N1流行株继续进化,HA基因属于6B.1A分支,HA蛋白新增 S74R、S164T、I295V 变异,与同一时期推荐的疫苗株A/Michigan/45/2015 核苷酸同源性在98.1%～98.5%之间,氨基酸同源性在98.1%～98.9%之间。其中一部分流行株HA蛋白还出现S183P、T256I氨基酸位点突变,属于6B.1A1分支。另一部分流行株未出现S183P氨基酸位点突变,但出现A256T氨基酸位点突变。

2018—2019年甲型H1N1流感病毒继续进化,一部分流行株HA蛋白出现N260D位点突变,属于6B.1A5分支;另一部分流行株 HA蛋白未出现N260D位点突变,又分别分化为6B.1A2分支、6B.1A4分支、6A.1A6分支和6A.1A7分支。分別有L233I氨基酸位点突变(6B.1A2分支),A141E共同氨基酸位点突变(6B.1A4分支),T120A共同氨基酸位点突变(6A.1A6分支)和K302T、I404M、N496S、E506D共同氨基酸位点突变(6A.1A7分支),与同期疫苗株A/Michigan/45/2015的核苷酸同源性在97.5%～98.3%之间,氨基酸同源性为97.7%～98.9%。

2019—2020年甲型H1N1流行株是由上一年度6B.1A5分支的流行株进化而来,其HA 蛋白新出现D187A、Q189E位点突变,进化为6B.1A5A1分支,与同期推荐的疫苗株A/Brisbane/02/2018 的核苷酸同源性在98.4%～98.8%之间,氨基酸同源性为97.9%～98.5%。与2020—2021年推荐的疫苗株 A/Guangdong-Maonan/SWL1536/ 2019的核苷酸同源性在99.5%～99.9%之间,氨基酸同源性为99.4%～100%,见图2。

图2 2016-2020年度长春市甲型H1N1流感病毒HA基因系统进化树

2.3 HA蛋白分子特征分析

2.3.1HA抗原决定簇位点分析 2016—2017监测年度的甲型H1N1流感病毒毒株与同期推荐的疫苗株A/California/07/2009相比,在HA蛋白抗原决定簇上都发生S162N和K163Q位点的共同突变,均位于HA蛋白抗原决定簇的Sa区;S185T的共同突变,位于HA蛋白抗原决定簇的Sb区;S203T位于HA蛋白抗原决定簇Ca区。除此之外,HA蛋白抗原决定簇还存在一些散在的突变位点,本研究中1株毒株出现S71F氨基酸位点突变,1株毒株出现S74R氨基酸位点突变,均位于HA蛋白抗原决定簇Cb区;1株毒株出现K160T氨基酸位点突变,位于HA蛋白抗原决定簇Sa区;1株毒株还出现K169R、S190R氨基酸位点突变,分别位于HA蛋白抗原决定簇Ca区和Sb区。

2017—2019监测年度的甲型H1N1流感病毒毒株与同期推荐的疫苗株A/Michigan/45/2015相比,在HA蛋白抗原决定簇上都发生S74R和S164T的共同突变,分别位于HA蛋白抗原决定簇的Cb区和Sa区。除此之外,与同期推荐的疫苗株A/Michigan/45/2015相比,HA蛋白抗原决定簇还存在一些散在的突变位点。本研究中的1株毒株出现A73S氨基酸位点突变,位于HA蛋白抗原决定簇Cb区;3株毒株出现H138Y氨基酸位点突变,1株毒株出现G140R氨基酸位点突变,2株毒株出现A141E氨基酸位点突变,1株毒株出现A141T氨基酸位点突变,均位于HA蛋白抗原决定簇Ca区;5株毒株出现L161I氨基酸位点突变,位于HA蛋白抗原决定簇Sa区;5株毒株还出现T185I氨基酸位点突变,2株毒株还出现S190I氨基酸位点突变,均位于HA蛋白抗原决定簇Sb区;1株毒株出现I166F和S190I氨基酸位点突变,分别位于HA蛋白抗原决定簇Ca区和Sb区;1株毒株还出现T185I和E235D氨基酸位点突变,分别位于HA蛋白抗原决定簇Sb区和Ca区。

2019—2020监测年度的甲型H1N1流感病毒毒株与同期推荐的疫苗株A/Brisbane/02/2018 相比,在HA蛋白抗原决定簇上都发生T185I、D187A和Q189E的共同突变,均位于HA蛋白抗原决定簇的Sb区。

2.3.2受体结合位点分析 甲型H1N1流感病毒位于HA蛋白头部的受体结合位点由190螺旋(187～195：187-DQQSLYQNA-195位)、220环(218～225：218-PKVRDQEG-225位)和130环(132～135：132-VTAA-135位) 3个结构域以及口袋底部的Y91、W150、H180和Y192构成。通过软件与A/California/07/2009对比,发现2019年12月以后分离到的毒株HA基因所编码的氨基酸出现D187A、Q189E位点共同突变,均位于HA蛋白受体结合位点190螺旋上。

2.3.3糖基化位点分析 甲型H1N1流感病毒HA蛋白分子原有的糖基化位点有8个,分别是第10、11、23、87、276、287、481和540位。2016-2017监测年度的甲型H1N1流感病毒毒株与同期推荐的疫苗株A/California/07/2009相比,HA蛋白162位糖基化位点为162NQS。另外,1株毒株HA蛋白出现T278I位点突变,导致276位糖基化位点缺失。

2017—2019监测年度的甲型H1N1流感病毒毒株与同期推荐的疫苗株A/Michigan/45/2015相比,甲型H1N1流感毒株HA蛋白的第162位糖基化位点由NQS变异成NQT,虽未影响糖基化位点的增减,但是否有功能方面的意义还有待进一步研究。另外,1株毒株 HA蛋白出现T278A位点突变,导致276位糖基化位点缺失;1株毒株 HA蛋白出现G482E位点突变,但未影响糖基化位点的增减。

而2019—2020监测年度的甲型H1N1流感病毒毒株与同期推荐的疫苗株A/Brisbane/02/2018 相比,HA蛋白162位糖基化位点均为162NQT。另外,1株毒株HA蛋白出现G482E位点突变,但未影响糖基化位点的增减。

2.3.4致病性位点分析 2016—2020年4个监测年度甲型H1N1流感病毒HA蛋白裂解位点氨基酸序列为I(V)PSI(V)QSR↓GLFGAIA,只含有一个碱性氨基酸为精氨酸R,未出现多个碱性氨基酸(R、K、H)。

另外,甲型H1N1流感病毒的HA1蛋白第222位氨基酸位点突变也被证实与病毒致病性密切相关。HA1第222位为D时,病毒主要识别人上呼吸道α-2,6-半乳糖唾液酸受体,HA1蛋白第222位一旦出现D222E、D222N或D222G突变,病毒就会更容易与下呼吸道α-2,3-半乳糖唾液酸受体结合,增加感染人下呼吸道的可能,从而使患者出现肺炎等严重的下呼吸道症状。经分析,发现2018年1株样本来源为长春市中心医院的甲型H1N1流感病毒分离株A/Jilin-Nanguan/SWL1204/2018(H1),其HA蛋白出现D222N的突变,我们后续还对此毒株进行了全基因组序列分析。

3 讨论

一般认为,甲型H1N1流感病毒的HA蛋白内部有4个抗原决定簇[2],分别是(不计信号肽)：Sa(124、153～157、159～164)、Sb(184～195)、Ca(137～142、166～170、203、221、235) 以及 Cb(70～75),这44个氨基酸是甲型H1N1流感病毒与宿主细胞受体相互作用的重要位点,因此突变可能使病毒具有免疫逃逸的能力,从而引起流行。以上位点若出现4个以上氨基酸位点突变,且突变涉及到2个及以上抗原决定簇位点;或一个涉及到抗原决定簇,另一个涉及到受体结合位点,就可以认为是具有流行病学意义的抗原变异株[3-4]。对长春地区2016—2020年4个监测年度甲型H1N1流行株的HA蛋白抗原决定簇分析,发现2016—2017年流行株相对于同期推荐的疫苗株A/California/07/2009,有4个共同突变涉及到了3个不同的抗原决定簇区域,因此提示2016—2017监测年度的甲型H1N1流感流行株与同期的疫苗株匹配度不理想,一定程度上也说明需要更换当时的疫苗组分,根据流行株的情况重新筛选甲型H1N1疫苗株,使疫苗株更好地匹配流行株,以保证流感疫苗对接种者的保护作用,从而预防甲型H1N1流感病毒大流行。

血凝素HA蛋白识别并结合宿主细胞表面的受体是流感病毒感染的关键步骤[12]。甲型H1N1流感病毒HA蛋白受体结合位点上关键氨基酸的变异可能会改变其受体结合的特异性,从而会影响流感病毒的传播。分析发现2019年12月以后分离到的毒株HA基因所编码的氨基酸出现D187A、Q189E位点共同突变,均位于HA蛋白受体结合位点190螺旋上,这很可能就会改变甲型H1N1流感病毒受体结合的特异性,从而会影响流感病毒在宿主间的传播。

糖基化所形成的寡糖侧链会影响蛋白质的折叠,结构的稳定性和生物活性。因此糖基化位点的改变或数目的增减会影响病毒的稳定性、传染性和致病性。通过软件与早期疫苗株A/California/07/2009对比,发现2016—2020年长春地区甲型H1N1流感病毒HA基因所编码的氨基酸新增了一个162位糖基化位点。

除此之外,其它因素也会影响甲型H1N1流感病毒的致病性。流感病毒HA的前体是未成熟的HA0,只有HA0被水解成由二硫键连接的HA1和HA2两个亚基后才可以感染宿主细胞。许多研究发现,HA蛋白中HA1和HA2裂解位点的碱性氨基酸的数量会影响HA蛋白对宿主蛋白酶的敏感性,从而影响流感病毒的致病性[5-6]。流感病毒HA裂解位点氨基酸序列中如果含有多个碱性氨基酸,则表现为高致病性,比如高致病性禽流感H5N1、H7N9等;如果只含有一个碱性氨基酸位点则表现为低致病性。经分析,发现2016—2020年4个监测年度甲型H1N1流感病毒HA蛋白裂解位点氨基酸序列只含有一个碱性氨基酸为精氨酸R,未出现多个碱性氨基酸。另外,HA1蛋白第222位出现D222E、D222N或D222G突变,会引起患者下呼吸道症状,已经在国际上引起共识[7-11]。经分析,发现2018年1株样本来源为长春市中心医院的甲型H1N1流感病毒分离株,其HA蛋白出现D222N的突变,提示此毒株可引起患者严重的下呼吸道症状。

目前,流感病毒和新冠病毒仍是引起全球大流行的重要呼吸道病原。随着北半球流感季的到来,未来可能会出现流感病毒和新冠病毒叠加流行的风险。我们在警惕和监测新冠病毒持续变异的同时,还应继续加强对流感病毒的抗原性、致病性、耐药性等方面的监测,防止由于流感病毒的变异和重组,引起新冠和流感合并感染,从而加大患者出现重症和死亡的风险。