黄瓜CBP60 基因家族鉴定及表达分析

纽晓润，王金耀，高 阳，南江峰，张朝文，李 森，邢国明

(1.山西农业大学 园艺学院，山西 太谷 030801；2.山西省设施园艺工程技术中心，山西 太谷 030801）

黄瓜（Cucumis sativusL.）属葫芦科一年生草本植物，起源于喜马拉雅山南麓的印度北部地区，是世界上重要的蔬菜经济作物［1-2］。2020 年联合国粮食及农业组织（FAO）统计，我国黄瓜栽培面积与产量跃居全球第一。近年来全球气候趋向于极端化，各类农作物面临着严峻的盐渍化等非生物逆境的挑战［3］。我国土壤同样也面临着严峻的盐渍化危害，国内盐渍化的耕地总面积约有0.36 亿hm2，占总耕地面积的5%［4］。黄瓜由于根系脆弱、好气、分布较浅，对盐胁迫十分敏感，土壤含盐量过高会对黄瓜的生理生化活动及生长进程造成严重影响，进而降低其产量和品质，极大地影响经济效益［5］，因此，黄瓜盐胁迫优质基因的挖掘具有重要的理论与实践意义。

植物在响应非生物胁迫时，会通过激活各种信号通路来促进对植物的感知，其中包括钙信号通路［6］、MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）级联反应和其他信号通路［7-8］。在逆境胁迫下，植物细胞将传递Ca2+内流产生的钙信号，使胞质内的Ca2+被H+/Ca2+酶和Ca2+-ATP 酶重新转运回到钙库，从而终止胁迫信号的传导［9］。在高等植物中，主要有3 类钙受体蛋白家族: 钙调素(Calmodulins，CaMs)和类钙调素蛋白(CaM-like proteins，CMLs)，类钙调神经磷酸酶B 蛋白(Calcineurin B-like proteins，CBLs)和钙依赖蛋白激酶(Ca2+-dependent protein kinases，CDPKs)［10-11］。CaM 作为研究最广泛的Ca2+效应器之一，能通过与下游的钙调素结合蛋白(Calmodulin binding proteins，CaMBPs)互相作用参与调控植物各种生理活动，尤其是在逆境胁迫的响应中发挥重要功能［12］。钙信号通路对黄瓜生长发育尤为重要，Ca2+直接参与调控非生物胁迫等生理活动［13-14］，因此，对黄瓜钙调素蛋白家族的研究具有重要的理论意义。

CBP60s(Calmodulin-binding protein 60)是植物所特有的钙调素结合蛋白家族之一［15］，在应对生物胁迫时发挥重要作用。前人在拟南芥中已鉴定出8 个CBP60s 家族成员，即AtCBP60a-g和SARD1［16］，CBP60 蛋白具有保守结构域CaM，该结构域可能结合Ca2+参与拟南芥中Ca2+介导的信号途径［17-18］，已有研究表明，CBP60 家族的大多数成员在病原体和抗旱性中起作用［19-20］，其中CBP60g 在拟南芥中参与增强对干旱的耐受力和水杨酸(SA)的积累，以及对脱落酸（ABA）的超敏反应和抗病防御反应起非常重要的作用［20］，另外还有研究报道CBP60g在拟南芥中会抑制蔗糖和激动素诱导的花青苷积累［21］。Pallegar 等研究表明在油菜素内酯(BR)和盐处理下AtCBP60f 和AtCBP60g 上调表达［22］。Yu等在大豆中发现19 个CBP60 家族成员，对大豆进行干旱和盐胁迫处理后发现，GmCBP60A-1基因可以提高植株对干旱和盐胁迫的耐受性［23］。CBP60家族基因在植物非生物胁迫中发挥重要的功能，但在黄瓜中却鲜有报道，因此，CBP60 家族的鉴定与分析对研究黄瓜如何应对非生物胁迫具有重要指导意义。

本研究利用生物信息学手段，对黄瓜CBP60 基因家族进行鉴定，综合分析其染色体定位、理化性质、基因结构、保守基序、系统进化、共线性和顺式作用元件等，并基于转录组数据信息，探索CBP60基因在黄瓜不同组织及盐胁迫下的表达模式，为CBP60 基因对黄瓜盐胁迫响应研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 黄瓜CBP60 基因家族成员鉴定及染色体定位

从文献中获得已报道的8 个拟南芥CBP60 基因ID，通过TAIR 数据库获得拟南芥（Arabidopsis thaliana）CBP60 基因家族成员的蛋白序列信息，并从黄瓜数据库CuGenDB（http://cucurbitgenomics.org）下载黄瓜基因组数据信息。将拟南芥CBP60基因家族成员比对至黄瓜9930_V3 版本基因组，比对结果上传至NCBI 中的Swiss-Port 数据库（https://www.uniprot.org/）进行再次比对，初步获取家族成员。在Pfam 数据库（https://pfam.xfam.org/）下载CBP60 保守结构域（PF07887）隐马尔可夫模型（Hidden markovmodel，HMM）文件，利用TBtools［24］进行结构域验证，最终确定黄瓜CBP60 基因家族成员。

利用TBtools 分析黄瓜CBP60 基因家族成员在染色体上的分布信息及黄瓜CBP60 基因间的串联重复事件和黄瓜基因密度信息，并绘制CsCBP60 的染色体定位及基因密度图。

1.2 蛋白序列理化性质及亚细胞定位分析

利用TBtools 预测CsCBP60 基因的氨基酸数目、相对分子量、理论等电点、不稳定系数、脂溶指数、亲水性平均系数。通过Cell-PLoc 2.0（https://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）网站对黄瓜CBP60 蛋白进行亚细胞定位预测。

1.3 基因结构和保守结构域分析

通过Bacth CD-search 搜索保守结构域，并利用TBtools 对基因结构和保守结构域进行分析与可视化。为进一步分析CBP60 蛋白的保守基序，利用MEME 在线网站（http://meme-suite.org/) 对序列进行分析，重复次数设定为0 或1，搜索数量设置为10［25］。

1.4 系统发育及共线性分析

为探究黄瓜、拟南芥、番茄、甜瓜的CBP60成员的进化关系，本研究利用上述1.1 中的方法，鉴定出番茄、甜瓜的CBP60 基因家族成员，使用MEGA 11 软件中的Neighbor-Joining 法(Bootstrap replications=1000)对所鉴定到的黄瓜、拟南芥、番茄、甜瓜蛋白序列构建系统发育树。通过TBtools 查找黄瓜与拟南芥、番茄、甜瓜之间的共线性关系，并对四者的全基因组基因密度进行统计，使用circos功能进行可视化。

1.5 顺式元件功能预测分析

为鉴定CBP60 基因相关顺式作用元件，使用TBtools 软件提取黄瓜CBP60 基因的CDS 序列上游2 000 bp 碱基作为其启动子序列，通过PlantCARE数据库（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）预测顺式元件，TBtools 结合预测结果与黄瓜基因结构注释文件进行可视化。

1.6 基于转录组数据分析黄瓜CBP60 基因表达模式

为探究黄瓜CBP60 基因的组织特异性表达，本研究在CuGenDB 网站上公布的RNA-seq 数据库中下载黄瓜不同组织（PRJNA80169）和NaCl 处理（PRJNA437579）的转录组数据，通过TBtools 软件对数据进行质控，然后进行读段计数，最终获得基因表达量（FPKM）。在整理黄瓜CBP60 基因在黄瓜不同组织和NaCl 处理的表达量后通过TBtools绘制热图进行数据可视化。

1.7 植物材料与处理

本试验选用黄瓜‘AM070’为材料。选用饱满的种子，在清水中培养3 d 后，加入营养液（EC 值为0.8）中培养4 d，在25 ℃盐胁迫为 150 mmol/L NaCl 溶液浸泡幼苗根部24 h。每个处理设置3 个生物学重复。培养结束时，取黄瓜幼根，清水清洗后短暂吸干，速冻在液氮中，用于提取总RNA。

1.8 RNA 提取与qRT-PCR 验证

使用 TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit 试剂盒提取以上冻存组织的总RNA。所有RNA用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法进行分析。使用反转录试剂盒PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)将RNA 反转录为cDNA，使用荧光染料2x Realtime PCR Super mix(SYBRgreen,with anti-Taq)进行qRT-PCR 试验，反应体系和程序参照试剂说明书，每个样品3 次生物学重复和3 次技术重复。相对表达量计算方法采用2-ΔΔCt法，使用 Graphpad 作可视化绘图，引物序列如表1 所示。

表1 qRT-PCR 引物Table 1 Primers for qRT-PCR

2 结果分析

2.1 黄瓜全基因组中CBP60 基因鉴定与染色体定位

在TAIR 中下载AtCBP60s 蛋白序列，通过双向BLAST 及TBtools 的HMMER search 功能搜索CsCBP60s,共鉴定到17 个候选CsCBP60s 基因家族成员，命名为CsCBP60-1～CsCBP60-17相比之前报道的拟南芥（8 个AtCBP60s）多9 个成员，比大豆（19 个GmCBP60s）少2 个成员。基于黄瓜基因组信息对CsCBP60s 进行染色体定位分析，结果如图1，17 个黄瓜CsCBP60s 基因不均匀分布在chr1、chr2、chr4、chr5 上，在chr3、chr6、chr7 上未分布，家族成员主要集中在chr1 上，共14 名成员，其中CsCBP60-4～CsCBP60-14紧密排列形成基因簇，说明其具有类似功能，在chr2、chr4、chr5 上各有一名成员。

图1 CsCBP60 家族成员基因在染色体上的分布及黄瓜基因密度图Fig.1 Distribution of CsCBP60 family genes on chromosomes

通过分析基因重复事件，发现在黄瓜CBP60家族成员间存在6 个串联重复事件（图1），表明串联重复事件是黄瓜CBP60 基因家族扩张的主要原因。

2.2 黄瓜CBP60 家族基因理化性质及亚细胞定位

利用TBtools 对17 个黄瓜CBP60基因氨基酸序列进行理化性质分析。结果显示，CsCBP60基因的氨基酸序列长度在153 aa（CsCBP60-17）到875 aa（CsCBP60-13）之间；17 个黄瓜CBP60 的蛋白质相对分子质量差异较大，位于17 307.87 ～99 117.13 Da，相对分子质量最高的是CsCBP60-17，相对分子质量最低的是CsCBP60-13；CsCBP60 的等电点在5.55 ～9.96 之间波动，CsCBP60-17（9.96）等电点最高，CsCBP60-4（5.55）等电点最低，其中CsCBP60-1/3/4/5/7/8/9/11/12/13/14/15/16 的等电点均小于7，这说明这12 个蛋白属于酸性蛋白，其余5 个（CsCBP60-2/5/6/10/17）等电点大于7，属于碱性蛋白。CsCBP60 蛋白不稳定系数在18.8 到55.5之间，其中有8 个（CsCBP60-5/6/7/8/9/11/16）不稳定系数小于40，表明蛋白质稳定性好，有9 个（CsCBP60-1/2/3/4/10/12/13/14/15）不稳定系数大于40，说明这几个蛋白可能不稳定；CsCBP60 蛋白的脂溶指数均为正值，正值越大表明疏水性越强，结果表明CsCBP60-5（92.04）蛋白的疏水性最强，CsCBP60-16（71.4）蛋白的疏水性最弱。CsCBP60蛋白水性平均系数均为负数，说明CsCBP60 均为亲水性蛋白。通过亚细胞定位预测，结果发现除CsCBP60-15仅定位于细胞核外，其余成员均定位于叶绿体中，CsCBP60-6定位于细胞核中、CsCBP60-17定位于细胞核、线粒体中（表2）。

表2 黄瓜CBP60 基因家族基因理化性质分析及亚细胞定位Table 2 Physicochemical properties and subcellular localization of cucumber CBP60 gene

2.3 基因结构和保守结构域

通过TBtools 对基因结构及进化关系进行分析，黄瓜CBP60 家族成员的外显子、内含子、CDS 特征个数数目差异明显（表3），处于2 ～22 之间，其中CsCBP60-5（2 个）外显子数目最少，数目最多的是CsCBP60-13（22 个）；另外内含子数目为1 到21 不等，其中CsCBP60-5含有1 个内含子，CsCBP60-13含有21 个内含子；黄瓜CBP60 家族成员中CsCBP60-9（2 个）的转录本的CDS 特征个数最少，CsCBP60-15（22）的转录本的CDS 特征个数最多；在分析成员转录本的UTR 特征个数时发现，其中CsCBP60-3/4/6/11均无UTR，另外有1 个成员含有1 个UTR，8 个成员含有2 个UTR，4 个成员含有3 个UTR。

表3 黄瓜CBP60 基因结构分析表Table 3 Structur of CBP60 gene in cucumber

利用在线工具通过Bacth CD-search 搜索结构域，结果表明，CsCBP60 家族成员都含有CaM 结合结构域（图2）。为探究黄瓜CBP60 基因家族成员的进化关系及保守基序，通过在线网站MEME 和TBtools 进行分析，结果显示，17 个CsCBP60 基因在保守基序方面具有较高的一致性，Motif2 在所有CsCBP60s 蛋白上均出现（图2）。根据进化关系聚类发现，同一分支上的成员具有相似的保守基序，仅有CsCBP60-13、CsCBP60-14、CsCBP60-16具有motif10，因此它们被划分为同一分支。

图2 CsCBP60 基因家族成员的系统进化及结构特征Fig.2 Phylogenetic and structural characteristics of CsCBP60 gene

2.4 系统发育及共线性分析

为了进一步了解黄瓜CBP60 基因家族的进化关系。本研究利用MEGA 11 对黄瓜（17）、拟南芥（8）、番茄（11）、甜瓜（13）中CBP60 基因家族成员构建系统进化树。结果如图3 所示，黄瓜、拟南芥、番茄、甜瓜最终被分为3 个组（ClassA-ClassC），其中ClassC 组 中 仅 有CsCBP60-15和MELO3C004202两个基因，说明这2 个基因同缘关系较强，可能具有相似的功能。拟南芥和番茄的CBP60 基因主要聚集在ClassA 组中，说明拟南芥和番茄CBP60 成员在进化上关系较近，黄瓜CBP60 基因主要分布在ClassB 组中，而在ClassB 中仅有黄瓜和甜瓜2 个物种，说明与番茄和拟南芥相比，黄瓜中CBP60基因和葫芦科的甜瓜中的CBP60 基因的亲缘关系更近，黄瓜与拟南芥、番茄CBP60 成员在进化关系上较远。

图3 黄瓜CBP60 成员系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of CBP60 genes

为进一步了解黄瓜CBP60 家族基因的进化过程，本研究分析了CsCBP60s 在4 个物种（黄瓜、拟南芥、番茄、甜瓜）中的共线性关系（图4），在拟南芥中发现5 对共线性关系，其中4 对位于黄瓜1 号染色体上，1 对位于黄瓜2 号染色体上；在番茄中发现6 对共线性关系，其中5 对位于黄瓜1号染色体上，1 对位于黄瓜2 号染色体上；在甜瓜中有10 对共线性关系，数量最多，其中8 对位于黄瓜1 号染色体上，其余2 对分别位于黄瓜的2、4 号染色体上，这也验证了上述的结论，黄瓜中的CBP60 基因与甜瓜中的CBP60 基因亲缘关系最近，并且推测位于黄瓜1 号染色体上的CBP60 基因在进化过程中具有较高的保守性。通过基因密度统计发现，黄瓜与拟南芥相比，基因密度较低，说明其生物复杂性较高。

图4 黄瓜、拟南芥、番茄、甜瓜CBP60 基因的共线性及基因密度图Fig.4 Collinearity and gene density map of CBP60 gene in cucumber, Arabidopsis, tomato and melon

2.5 顺式元件功能预测分析

为探究黄瓜CBP60 基因家族成员的生物学功能和调控模式，本研究对黄瓜CBP60 基因序列上游2 000 bp 序列进行启动子分析。结果发现，在17 个黄瓜CBP60 基因启动子中共搜索到24 个胁迫响应元件，其中包括厌氧诱导、脱落酸响应、生长素响应、水杨酸响应、赤霉素响应、低温响应、干旱响应、防御胁迫响应、损伤响应等元件，这说明CsCBP60可能参与植物体内多种生理生化过程（见图5）。其中黄瓜CBP60 基因均包含光响应元件，已有研究报道中指出，盐胁迫会导致黄瓜光合色素、净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）和胞间CO2浓度（Ci）等 光 合 指 标 下 降［27］。脱 落 酸（abscisic acid，ABA）是植物响应干旱、盐胁迫等逆境产生的一种内源激素，有研究表明盐胁迫使植物体内ABA 和IAA 等激素水平上升［27-28］，黄瓜CBP60 家族成员中CsCBP60-2/6/12/13/14/15均含有脱落酸响应元件（ABA responsiveness）和生长素响应元件（IAA responsiveness），推测可能与盐胁迫相关。

图5 黄瓜CBP60 基因顺式元件分布图Fig.5 Cis-elements distribution of cucumber CBP60 genes

2.6 CsCBP60s 在黄瓜组织中的表达分析

黄瓜CBP60 基因在黄瓜组织在根、茎、叶、受精子房、子房、未受精子房、雌花、雄花、卷须基部和卷须组织中的表达水平显示，除CsCBP60-5、CsCBP60-17在黄瓜组织中不表达，其余CsCBP60基因均在不同组织中有相应表达（见图6）。

图6 黄瓜CBP60 基因在黄瓜组织中的表达模式Fig.6 Expression patterns of cucumber CBP60 genes in cucumber tissues

其中CsCBP60-1在雄花及未受精子房中表达量较高，CsCBP60-3在未受精子房和受精子房中表达量较高，CsCBP60-7、CsCBP60-8在根部、卷须部位表达量较高，其余部位表达量低。CsCBP60-9在雄花、根部表达量较高，CsCBP60-13在叶片中表达量较高，CsCBP60-15在未受精子房中表达较高。另外还发现大部分CsCBP60 基因在根部均有较高表达。综上所述，CsCBP60 基因主要在根部表达略高，表明对非生物胁迫的响应主要在根部。

2.7 CsCBP60s 在盐胁迫的表达分析

盐胁迫是常见的非生物胁迫因子之一，土壤中盐分过多会影响植物吸水、破坏细胞膜结构、抑制呼吸作用、最终影响营养物质的吸收［29］。本研究为探究黄瓜CBP60s 在盐胁迫下的响应模式，通过CuGenDB 网站下载来自黄瓜幼苗在NaCl 处理（PRJNA437579）下的RNA-seq 数据。对数据进行处理分析后获得黄瓜CBP60 基因在NaCl 处理下的表达量，利用TBtools 绘制热图。结果显示，有13 个基因表达量有不同倍数的上调，CsCBP60-14表达量下调（见图7）。

图7 黄瓜CBP60 基因在NaCl 处理下的表达热图Fig 7.Heat map of CBP60 gene expression in cucumber treated with NaCl

其中CsCBP60-1/3/7/8/9/11/12/15对NaCl 响应强烈，且这些基因在根部表达量相对较高。有研究表明，根系是植物最先感知盐渍环境存在的器官，进而产生相应变化以提高对环境适应能力，可以推断出这些基因可能在黄瓜抵抗盐胁迫时发挥重要作用。CsCBP60-13、CsCBP60-16、CsCBP60-17在NaCl 处理下，表达量无明显变化，推测这3 个基因参与其他功能。

2.8 CsCBP60 基因在盐胁迫下的表达分析

为验证RNA-Seq 数据准确性，研究黄瓜中CsCBP60 基因家族对盐胁迫的反应，本研究选择10 个CsCBP60 家 族 成 员，分 别 为CsCBP60-1、CsCBP60-2、CsCBP60-3、CsCBP60-7、CsCBP60-8、CsCBP60-9、CsCBP60-10、CsCBP60-11、CsCBP60-12、CsCBP60-15。如图8所示，在150 mmol/L NaCl 溶液盐胁迫下，与对照相比，该10 个基因均呈现上调趋势，且相对表达量均显著高于对照，与转录组数据结果一致。

图8 10 个黄瓜CsCBP60 基因盐胁迫处理下相对表达量Fig 8.Expression pattern analysis of CsCBP60 genes under salt stress

3 讨论与结论

CBP60s 是植物中特有的可以结合CaM 的转录因子家族，参与调节植物的多种非生物胁迫。CaM作为研究最广泛的Ca2+敏感蛋白之一，是Ca2+参与的信号转导途径中的重要成员［30］，Ca2+是植物细胞信号转导中最基本的第2 信使，它几乎介导植物生长发育的所有反应，许多环境胁迫如高盐和干旱、低温、氧化胁迫及机械伤害均可引起细胞内游离Ca2+浓度的增加［31］。多数CBP60 家族成员已被发现参与盐胁迫、干旱、抗病、免疫和SA 积累等［32-33］。

本研究在黄瓜全基因组中鉴定出17 个CsCBP60基因成员，并对其进行全面分析，包括染色体定位、理化性质、基因结构、保守基序、系统进化、共线性和顺式作用元件和表达模式分析。CsCBP60基因不均匀分布在chr1/2/4/5 上，并在chr1 上以基因簇的形式呈现，这与大豆CBP60 基因在染色体上的分布有所不同。与拟南芥、番茄相比，黄瓜中的CBP60 基因与甜瓜中的CBP60 基因亲缘关系更近，在ClassB 中紧密聚集在一起。据报道，拟南芥中的CBP60 基因与大豆中的CBP60 基因表现出更近的亲缘关系。本研究对17 个黄瓜CBP60 基因启动子上游顺势元件功能分析时发现，在黄瓜中CBP60 基因的启动子区中，分布有多种与激素、胁迫和发育环境调节相关的顺式功能元件，其中包含ABA 响应、E-box、W-box 等顺式作用元件。ABA 诱导型基因在其启动子区域含有一个保守的ABA 响应顺式作用元件 ABRE(ABA-Responsive Element),它是参与ABA 调控、参与盐胁迫响应的基因表达的顺式作用元件［34］。E-box［35］、W-box［36］顺式元件均响应盐胁迫。大豆CBP60 基因启动子中同样存在ABRE顺式元件，且研究发现一些GmCBP60 基因在干旱和盐胁迫下能被显著诱导。为验证黄瓜CBP60 基因在NaCl 处理下的表达模式，分析了CsCBP60 基因在黄瓜根、茎、叶、受精子房、子房、未受精子房、雌花、雄花、卷须基部和卷须组织的时空表达差异以及NaCl 处理下的基因表达模式，发现CsCBP60基因在NaCl 处理下，有13 个基因表达量有不同倍数的上调，CsCBP60-14表达量下调，且这些基因在黄瓜根部表达量均较高。根系作为植物最先感知盐渍环境的器官，在盐胁迫下会做出相应变化以提高适应能力，以此推断CsCBP60 基因在盐胁迫反应中发挥作用。Wan D 和Pallegar 等研究发现拟南芥中过表达CBP60g 基因可以增强转基因株系耐旱和耐盐性［20,22］。Yu Q 等通过研究大豆CBP60 基因时发现，过表达GmCBP60A-1可以提高植株对盐胁迫的耐受性［23］，证明CBP60 家族成员在耐盐中起作用。本研究结果与前人相符，进一步证明黄瓜CBP60 基因在响应盐胁迫时发挥这重要作用。

综上所述，本研究利用生物信息学分析法在黄瓜中鉴定出17 个CBP60 基因家族成员，并分析了其在不同组织和盐胁迫下基因表达量差异，初步推断CsCBP60s 在根中表达较活跃，CsCBP60-1/3/7/8/9/11/12/15基因抵抗盐胁迫时发挥作用。本研究为进一步研究CsCBP60 基因的功能提供思路，也为研究黄瓜CBP60 基因家族在抗盐育种中奠定基础。