肾阴虚证和肾阳虚证血浆蛋白质表达谱的比较研究
2023-06-26毕建璐魏敏孙晓敏聂晓莉赵晓山罗仁
毕建璐 魏敏 孙晓敏 聂晓莉 赵晓山 罗仁
摘要：目的 本研究通过对肾阴虚证和肾阳虚证共同的血浆蛋白差异表达进行研究，挖掘肾虚证的本质。方法 对肾阴虚证、肾阳虚证和健康正常人进行蛋白芯片表达谱的比较研究。结果 选取典型肾阴虚证5例、肾阳虚证5例、正常健康人6例进行蛋白芯片检测，与正常健康人对比，获得2组间共同表达上调的差异蛋白BMP-5。结论 肾阴虚、肾阳虚证之间存在着共同的差异蛋白，这可能是2者均有肾虚的表现有关，这为探讨肾虚证的发生机制，特别是在蛋白水平的改变提供了依据。
关键词：肾阴虚证；肾阳虚证；蛋白组学；免疫紊乱
中图分类号：R692 文献标志码：B 文章编号：1007-2349（2023）04-0031-03
肾是人的先天根本，肾藏精，精化气，即为肾气，肾气有阴阳，故肾虚最先表现为肾气虚，肾气亏虚日久，则转化为肾阴虚或肾阳虚，由此可见，肾阴虚与肾阳虚有着共同的物质基础，那么这些共同物质基础是否有共同的基因、蛋白的改变？本课题组［1-4］前期对肾阴虚证、肾阳虚证进行了基因芯片的研究，发现肾阴虚证、肾阳虚证之间存在多个差异表达基因，但由于其中差异表达基因过多，每个差异表达基因又与多个信号通路、蛋白表达相关，非常复杂，不能深入探讨肾虚证的本质。蛋白质是基因表达的产物，能够更好地反映机体的功能特性，因此，本课题组招募肾阴虚证、肾阳虚证、正常人志愿者，对比三者的蛋白表达，挖掘肾虚证的本质。
1 资料与方法
1.1 一般资料 在某三甲医院招募肾阴虚证5例、肾阳虚证5例，正常健康人6例，其中男3例，年龄分别为30、32、35岁；女3例，年龄分别为年龄32、37、48岁。按1986年颁布的《中医虚证辨证参考标准》［5］判定阴虚证、肾阳虚证。
1.1.1 肾阴虚证的辨证标准［5］（1）主症：腰膝酸软，五心烦热。（2）次症：眩晕耳鸣，或耳聋，口燥咽干，潮热盗汗，或骨蒸发热，形体消瘦，失眠健忘，齿松发脱，遗精，早泄经少，经闭，舌质红、少津，少苔或无苔，脉细数。（3）诊断：主症具备2项（腰膝酸软必备），次症至少具备2项以上者即可确诊。
1.1.2 肾阳虚证的辨证标准［5］（1）主症：腰膝酸软，性欲减退，畏寒肢冷。（2）次症：精神萎靡，夜尿频多，下肢浮肿，动则气促，发槁齿摇，舌质淡苔白，脉沉迟，尺无力。（3）诊断：主症具备2项（腰膝酸软必备），次症至少具备2项以上者即可确诊。
1.1.3 排除标准 （1）年龄小于18岁，或者大于65岁。（2）妊娠或哺乳期妇女。（3）有心脑血管、肝、肾、造血系统等严重疾病患者。（4）有精神性疾病的。
1.1.4 主要试剂与仪器［6-8］人类生物素标记法抗体芯片，美国RayBiotech，货号：AAH-BLG-1-4）。主要仪器：超净工作台，低温高速离心机（Sigma-Aldrich公司），微量移液器（Eppendoff公司）。
1.2 实验方法［6-8］200 μL 1×PBS（pH=8）（20ul血浆＋80 μL 1×PBS）稀释5倍，并将稀释液装入透析管，4℃ 500 mL 1×PBS（pH=8）透析。更换1×PBS再次透析。芯片每个子阵加入400 μL封闭液，室温孵育30 min。去除封闭液，加400 μL样品，室温孵育2 h或4 ℃过夜。去除溶液，芯片放入30 mL离心管，加30 mL 1×洗涤液I，震荡10 min，去除洗涤液。重复2次。30 mL 1×洗涤液II洗涤芯片。30 mL蒸馏水洗涤，存于-20℃或-80℃。荧光扫描仪，Cy3通道检测。
1.3 统计学方法 用SAM软件分析，比较肾阴虚证组、肾阳虚证组与正常对照组的蛋白表达。筛选条件：︱Score（d）︱控制在2倍以上，代表該蛋白可能属于差异表达（d即difference，代表差值）。
2 结果
芯片扫描分析结果：对肾阴虚证5例、肾阳虚5例、正常健康人6例进行蛋白芯片分析，芯片对比507种靶蛋白，分析得出肾阴虚证组、肾阳虚证与正常健康人之间有明显差异的上调蛋白BMP-5（见图1）。检索公共数据库后，获得此差异蛋白的基本信息（见表1）。
3 讨论
中医认为，肾气的盛衰是机体生、长、壮、老、已的基石，是人体阴阳的根本。肾气与人的生长、发育、生殖，骨骼的生长密切相关。肾气亏虚则会出现腰膝酸软、五心烦热或畏寒肢冷、五更泄泻、五迟五软等，肾气亏虚日久，则会出现肾阴虚或肾阳虚的表现，也就是说，两者是存在共同的基础——肾气虚。本课题组应用蛋白芯片技术，与正常健康人比较，发现肾阳虚证与肾阴虚证共同的差异表达蛋白骨形态发生蛋白5（BMP5），主要涉及细胞凋亡、骨的合成等方面。中医认为，肾藏精，主人体的生长、发育和生殖，在体合骨，生髓。BMP5也与骨合成相关，与中医基础理论符合。
肾主骨，生髓：骨形态发生蛋白5（bone morphogenetic proteins-5，BMP-5），又名成骨蛋白，属于转化生长因子β超家族。目前已知的BMPs数量已经达到30余种。根据氨基酸序列的高度同源性，BMP5、BMP6和BMP7组成了BMPs的一个亚家族，其中hBMP5和hBMP6共同定位于人6号染色体上。在胚胎发育过程中，其与肢体关节的形成有关，是骨、软骨组织修复的必要成分之一［9］。马真胜等［10］应用骨形态发生蛋白-5（BMP-5）cDNA探针来检测骨折愈合过程中外骨痂内 BMP-5 基因表达的定位与分布。实验结果提示［11］，创伤可刺激BMP-5的基因表达，其表达局限于骨折周围的骨痂区。其表达可以使骨折的血肿具有成骨能力，是骨折愈合中骨痂形成的重要原因之一。笔者结果也表明，肾阴虚证和肾阳虚证有着共同的差异蛋白--骨形态发生蛋白-5（BMP-5），它与骨和软骨组织修复有着重要的关系，因此，肾虚证中常见的五软五迟、腰膝酸软、发堕齿稿等可能与BMP-5的异常表达有着密切的联系。
肾主生长、发育、生殖：中医认为，肾为先天之本，在人体生长、发育、生殖中起着重要作用。BMP-5可以在发育中的泌尿道上皮细胞中表达，在胚胎发育期输尿管、肾、肺、小肠、眼、乳腺等几乎胚胎分化中的关键均有BMPs的表达，其可反映结肠癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌等多种癌症的预后［12-13］。刘伟等［11］研究Bmp5短耳纯合型小鼠的耳廓比正常小鼠耳廓短小，纯合型突变畸形小鼠体形较小，胸骨、肋骨等骨骼的发育较正常小鼠存在明显异常。Bmp5短耳小鼠模型可用于先天性小耳畸形的研究。BMP-5在胚胎发育中的作用很可能是“肾藏精”的体现之一。
BMPs参与了胚胎的形成和发育、细胞的分化、增殖、诱导细胞凋亡。而目前尚无BMP5与中医肾病的关系的研究，下一步将针对BMP5进行研究。由于本研究的样本量偏小，今后将扩大样本量，寻找肾虚证的差异蛋白、基因，为探讨肾虚证的发生机制，特别是在蛋白水平的改变提供了依据。
参考文献：
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［4］魏敏，赵晓山，孙晓敏，等.肾阴虚证和肾阳虚证基因表达谱的比较研究［J］.山西医科大学学报，2012，43（9）：652-654，722.
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［6］毕建璐.肾阳虚证和肾阴虚证血浆蛋白表达谱的比较研究［D］.广州：南方医科大学，2011.
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［10］馬真胜，胡蕴玉，吕荣，等.骨形态发生蛋白5（BMP5）基因在骨折愈合中的定位研究［J］.中国骨伤，2001（11）：31-32.
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［12］Karim M A，Samad A，Adhikari U K，et al.A Multi-Omics Analysis of Bone Morphogenetic Protein 5（BMP5）mRNA Expression and Clinical Prognostic Outcomes in Different Cancers Using Bioinformatics Approaches［J］.Biomedicines，2020，8（2）：19.
［13］Chen E，Yang J，Zhao X，et al.MiR-32 promotes tumorigenesis of colorectal cancer by targeting BMP5［J］.Biomedicine & pharmacotherapy=：Biomedecine & pharmacotherapie，2018，106（12）：1046-1051.
（收稿日期：2022-04-08）
