镉胁迫对泥鳅氧化毒性及肝组织损伤效应

2023-06-25杜妙柔杨超超

延安大学学报（自然科学版） 2023年2期

雷忻，屈蓉，杜妙柔，杨超超，谭婷，王琪

（延安大学生命科学学院，延安市生态恢复重点实验室，陕西延安 716000）

镉（Cadmium，Cd）作为一种广泛存在于水体中的重金属污染物，具有毒性持久、难以消除的特点，对水生动物具有潜在危害性［1-2］。近年来，随着能源化工的快速发展，镉对水生生态系统产生一定影响，尤其是对鱼类的生存和繁殖有着显著的影响［3-4］。延河流域作为能源化工基地重要区域重金属镉污染较为严重，对其水生生物的生理生态毒性研究较为迫切。

目前，有关Cd 对水生生物的毒性效应研究较多。例如，刘艳平等［5］通过红细胞微核实验研究镉对小鳙鱼的遗传毒性发现，鳙鱼红细胞的微核细胞率随水环境中Cd2+浓度升高而升高，表现出剂量-效应关系。贾秀英等［6］研究表明，高浓度组镉对两栖类黑斑蛙肝脏指数呈逐渐减少的趋势，肝组织、肾组织、心脏组织Na+-K+-ATPase 随着暴露时间的延长，呈现出先升高后下降的趋势，表明Cd 对黑斑蛙作用是明显的时间、剂量-效应关系。雷忻等［7］研究发现，随着Cd2+浓度的升高、染毒时间延长，雄性泥鳅肝脏Vtg 呈升高的趋势，同时也表现了环境雌激素效应。关于Cd 对泥鳅的氧化毒性的基础数据报道得较少，有关Cd胁迫下泥鳅抗氧化机制响应研究对进一步探究环境污染物对鱼类代谢毒性、生殖毒性具有一定的参考意义。

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）和过氧化氢酶（Catalase，CAT）是两种重要的与氧化作用相关的酶。SOD 具有抗氧化和氧化平衡的功能，与很多疾病的产生有密切的关系［8］。SOD 存在于细胞质中，其作用将超氧阴离子（O2-）变成H2O2和O2；CAT 是一种主要的酶类清除剂，主要存在于红细胞和一些组织中，它是一种以铁卟啉为辅基的结合酶，可将产生的H2O2进一步转变为H2O，发挥机体抗氧化作用。泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus），隶属于鲤形目（Cypriniformes）、鳅科（Cobitidae）、泥鳅属（Misgunus），是一类小型硬骨淡水鱼，是一种重要的水环境监测的水生生物，分布范围广泛，适应性强，在实验室条件下易于驯养，适合作为毒理学实验动物［9-10］。本研究以泥鳅为研究对象，采用静水养殖法、邻苯三酚自氧化法、钼酸铵比色法检测Cd对泥鳅肝脏SOD和CAT活性的影响，并采用H·E染色法观察肝脏组织结构变化，为了解Cd对泥鳅的氧化毒性提供一定的参考依据，同时为推进延安地区可持续发展战略，控制环境污染，保持生态平衡，具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验用泥鳅平均体重11.86±3.0 g，平均体长11.8±2.5 cm。均由陕西省延安市水产养殖基地提供。将泥鳅在自然脱氯96 h 的自来水中驯养7 d，挑取体格强健活跃的泥鳅为研究对象。

采用静态水质接触染毒法对泥鳅染毒［11］，按照《国家渔业水质标准》（Cd2+浓度＜0.005 mg/L），参照文献［11-14］设置4 个浓度梯度0.005、0.050、0.500、5.000 mg/L 和1 个曝气自来水对照组，每组随机投放25条泥鳅，试验过程中每天更换受试药液。

1.2 实验药品与主要仪器

氯化镉（西安化学试剂厂）、钼酸铵（天津市凯达化工厂）、焦性没食子酸、伊红和苏木色精（天津博迪化工股份有限公司）。所有试剂均为分析纯。UV-2600 紫外可见分光光度计（日本岛津企业管理公司）、轮式切片机（德国）和Leica 正置光学显微镜DM6B。

1.3 抗氧化酶活性检测

同上取样，用4℃预冷生理盐水冲洗，用滤纸擦拭干燥表面，快速准确计量，加入用6.7 mmol/L磷酸盐缓冲液，冰浴中研磨成浆，以3 000 r/min、4 ℃离心20 min，取上清液放置于冰箱中，采用邻苯三酚自氧化法检测SOD 活性［15］，采用钼酸铵比色法检测CAT活性［16］。

1.4 肝脏组织结构观察

同上取样，放入Bouin’s 固定液中将其固定24 h，冲洗、脱水、透明、石蜡包埋、切片、染色，中性树脂封片，镜检、观察并拍照。

1.5 数据分析

采用SPSS 软件（版本v26.0）进行统计分析，统计结果用Origin软件制图，以及Microsoft Excel 2003处理以平均数±标准差的形式表示，分析各浓度处理组与对照组的差异显著性。其中，P＜0.05 表示有显著差异，P＜0.01表示有极显著差异。

2 结果与分析

2.1 Cd胁迫下雌、雄性泥鳅肝脏SOD活性的变化

由图1 可见，与对照组相比，雌性泥鳅在Cd 暴露下处理10 d，肝脏SOD 活性呈现上升趋势，在最高浓度组（5.000 mg/L）极显著升高（P＜0.01），并达到最大值；Cd 暴露20 d 时，0.050 mg/L 浓度组肝脏SOD 活性显著升高（P＜0.01），之后呈下降再升高的U形趋势；Cd暴露30 d时，0.005 mg/L浓度组SOD活性就极显著升高（P＜0.01），并达到最大值，之后呈下降再升高的U 形趋势。与对照组相比，雄性泥鳅在暴露10、20、30 d 时，最低Cd 浓度组（0.005 mg/L）SOD 活性均极显著升高（P＜0.01），之后随浓度增大，活性基本呈下降趋势；Cd暴露30 d时，SOD 活性在各浓度组均极显著上调（P＜0.01）。

图1 重金属Cd对泥鳅肝脏SOD活性的影响

2.2 Cd胁迫下雌、雄性泥鳅肝脏CAT活性的变化

由图2可见，与对照组相比，0.005、0.050 mg/L Cd浓度组在暴露第10 d 时，雌性泥鳅肝脏CAT 活性极显著升高（P＜0.01），之后随浓度继续增大而活性下降，5.000 mg/L 浓度组CAT 活性极显著降低（P＜0.01）；Cd暴露20 d时，各浓度组泥鳅肝脏CAT活性均极显著升高（P＜0.01），并随着浓度增大呈先升高后下降趋势；Cd 暴露30 d 时，0.050、0.500 mg/L 浓度组CAT 活性极显著升高（P＜0.01），但5.000 mg/L浓度组活性极显著降低（P＜0.01）；Cd 暴露10、20、30 d，0.050 mg/L 浓度组雌性泥鳅CAT 活性均达到最大值，之后随浓度增大均呈下降趋势。与对照组相比，雄性泥鳅在Cd 低浓度组（0.005 mg/L）暴露10、20、30 d，CAT活性均显著升高（P＜0.05）；Cd暴露20 d时，高浓度组（5.000 mg/L）CAT活性下降及其显著；雌、雄性泥鳅在相同暴露时间，CAT 活性均随Cd浓度增大，呈现升高后下降的趋势。

图2 重金属Cd对泥鳅肝脏CAT活性的影响

2.3 Cd胁迫下雌、雄性泥鳅肝脏的组织学变化

由图3 可以看出，空白对照组中，雌性、雄性泥鳅的肝脏细胞分布比较均匀，细胞核均在细胞中央，为圆形或者椭圆状（图3A、E）。与对照组比较，在低浓度0.050 mg/L Cd 中暴露30 d 后，肝组织间隙增大、空泡化（图3B、F）；随着浓度增加，雌性、雄性泥鳅肝组织中的细胞间隙进一步加大，同时发生严重的肝细胞肿大、空泡化、核溶解现象。在同一浓度下，雄性损伤要比雌性损伤结果更加明显。

图3 Cd胁迫下雌、雄性泥鳅肝脏组织结构变化

3 讨论

3.1 Cd对雌、雄性泥鳅氧化毒性效应

SOD 和CAT 是水生动物抗氧化酶系的重要成分，它们的变化可反映外源污染物对动物的氧化毒性效应。宋志慧等［17］发现低浓度氧化乐果会激活椎实螺体内酶活响应机制，导致CAT 活性升高；高浓度氧化乐果会损伤静水椎实螺抗氧化系统，使得CAT 活性降低。张楠等［15］通过研究Zn2+对大型溞（Daphniamagna）生理毒性时发现，在一定时间范围内，随Zn2+的浓度升高，大型溞SOD 和CAT 活性基本呈现出先诱导后抑制的规律。贾秀英等［16］对鲫鱼的研究也显示在低浓度的Cu2+、Cd2+的胁迫下，肝组织SOD 酶活性升高，随着Cu2+、Cd2+浓度的增大，酶活性又呈明显下降趋势。孙淑红等［18］研究表明低浓度Cd 胁迫下，泥鳅肝组织中SOD 活性即可被显著诱导。本研究中，雌性泥鳅在Cd暴露10 d时肝脏SOD 活性在最高浓度组（5.000 mg/L）表现为极显著升高，而在暴露30 d时，最低Cd浓度组（0.005 mg/L）SOD 活性就升高极其显著，并在相同时间，SOD活性呈下降再升高的U 形趋势，表明了雌性泥鳅肝脏组织在Cd暴露达到一定时间和剂量时，才显著诱导SOD 活性，产生较强的氧化毒性效应。而雄性泥鳅在Cd 暴露10 d 时，最低Cd 浓度组（0.005 mg/L）SOD活性就升高极其显著，并在相同暴露时间，SOD活性随着Cd浓度增加呈现出先上升后下降的趋势，提示低浓度Cd 即可对雄性泥鳅SOD 活性产生诱导作用，表现出明显的氧化毒性效应。因此，Cd 对雄性泥鳅SOD 活性诱导作用较雌性泥鳅强。雌性泥鳅在最低Cd 浓度组（0.005 mg/L）暴露10 d 时，肝脏CAT 活性升高就极其显著，在0.050 mg/L 浓度组暴露10 d、20 d、30 d 时，CAT 活性均达到最大值，之后随浓度增大均呈下降趋势。Cd 暴露中的雄性泥鳅CAT 活性变化趋势类似雌鱼，但变化程度不及雌鱼剧烈。泥鳅在Cd 胁迫下产生了大量的O2-，为了保护机体清除多的自由基，肝脏SOD 和CAT 的活性被大量激活，而随着时间延长，Cd在体内大量富集，对抗氧化系统产生损伤，又会抑制两种酶活性，因此具有一定的剂量-效应与时间-效应关系。

3.2 Cd对雌、雄性泥鳅肝组织损伤效应

肝脏是鱼体内重要的解毒器官，当有害物质进入机体后，会对肝组织结构造成一定程度的损伤［19］。沈文静等［20］研究表明斑马鱼短期接触敌草快后，肝细胞发生了肿胀、空泡，随着敌草快浓度的升高，肝组织的损害更加严重，肝细胞发生明显坏死，导致动物肝功能丧失而死亡。王文龙等［21］对吉富罗非鱼幼鱼的研究表明，铜可使肝脏表现出不同程度病变，随着铜浓度的增加，肝脏被诱导致浊肿变性和脂肪变性。王利等［22］观察到铜暴露下鲤鱼肝细胞有空泡变形、肿大、细胞核溶解的现象。本研究中，随着Cd浓度增加和染毒时间的延长，雌、雄性泥鳅肝细胞都出现空泡化、细胞肿大、核溶解、变形等组织结构异常，说明Cd可对泥鳅肝脏组织结构产生明显的损伤效应，并且对雄性损伤要比雌性损伤更为严重。