基于网络药理学探讨茵陈治疗急性胰腺炎的作用机制▲

蒙 诺 覃颖颖 杨慧莹 唐国都

(1 广西医科大学第一临床医学院,广西南宁市 530021;2 广西医科大学第一附属医院消化内科,广西南宁市 530021)

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是一种消化系统炎症性疾病[1]。2016年,全球AP发病率约为34/100 000[2]。AP以胆源性、酒精性为主[3-4],其主要特征是胰腺自身消化,随后出现炎症、水肿、空泡形成、坏死等病理过程,严重时可引起胰腺外器官损伤,目前多以对症治疗为主。在中医上,AP属于“食积腹痛”范畴,以痰湿质、肝胆湿热证为主,痰湿质是指在各种先天及后天因素作用下,因饮食摄入过度导致脾运化失常,体湿而痰多凝结,痰黏且浊。肝胆湿热证以湿热内蕴为主要特征,肝胆疏泄失常可有身目发黄、发热、胁肋胀痛等证候。临床上,AP以湿热、血瘀、肝胆郁热症状为主[5-6]。

茵陈为菊科植物滨蒿或茵陈蒿的干燥地上部分,又称茵陈蒿、绵茵陈、白蒿等[7],其味苦、辛,性微寒,归脾、胃、肝、胆经,具有清湿热、退黄疸的作用。药理学研究表明,茵陈具有抗炎、镇痛、解湿热、保肝利胆等多种功效[8]。目前,网络药理学是在系统生物学的理论基础上,应用网络数据库如中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)、DRUGBANK数据库、DisGeNET数据库等进行检索、数据挖掘、计算机模拟,对生物系统进行网络分析,已被广泛应用于各领域[9]。本文基于网络药理学,经TCMSP获取茵陈的有效活性成分及其作用靶点,利用Cytoscape 3.8.0软件构建“中药-活性成分-基因靶点-疾病”网络图,对茵陈治疗AP的相关靶点进行基因本体论(Gene Ontology,GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,为今后AP的中药治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 茵陈有效活性成分的筛选 以“茵陈”为检索词,利用TCMSP (http://tcmspw.com/tcmsp.php)检索茵陈的所有活性成分,并设定口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和药物相似性(drug likeness,DL)≥0.18作为茵陈有效活性成分的筛选条件,将结果导入Microsoft Excel软件。

1.2 茵陈有效活性成分作用靶点的筛选 利用TCMSP的“related targets”功能,获取茵陈有效活性成分对应的全部靶点。运用UniProt在线蛋白数据库 (http://www.uniprot.org) 和Perl软件,对靶点进行标准基因名转换。

1.3 AP相关靶点的筛选 以“acute pancreatitis”为检索词,利用GeneCards®数据库 (http://www.genecards.org/)和OMIM®数据库(http://omim.org/)进行检索,其中在GeneCards®数据库中设置Relevance score≥10。对两个数据库的检索结果进行合并、去重后,得到AP相关靶点。

1.4 茵陈治疗AP相关靶点的获取 通过Draw Venn Diagram在线工具 (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) 将茵陈有效活性成分的作用靶点和AP相关靶点取交集,绘制韦恩图,获得茵陈治疗AP的相关靶点。

1.5 构建“中药-活性成分-基因靶点-疾病”网络 将茵陈有效活性成分的作用靶点和茵陈治疗AP的相关靶点导入Perl软件进行映射,然后利用Cytoscape 3.8.0软件进行可视化处理,构建“中药-活性成分-基因靶点-疾病”网络图。利用Cytoscape 3.8.0软件内置的Network Analyzer计算度值、介数值。

1.6 蛋白-蛋白相互作用网络的构建 将茵陈治疗AP的相关靶点导入STRING数据库 (http://string-db.org/),应用“Multiple Proteins”功能,设置物种为人类、置信度>0.7,获得蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络图,节点为靶点蛋白,边为各靶点蛋白之间相互作用的关系,将结果导出,运用R语言将靶点蛋白的连接数目从高到低进行排序。

1.7 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 将茵陈治疗AP的相关靶点输入R语言Bioconductor包和ClusterProfiler包进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,设置P<0.05。

2 结 果

2.1 茵陈的有效活性成分 共筛选出茵陈的有效活性成分13个。其中,柳穿鱼黄素和3-[2,3-二氢-2-(2-羟基-1-甲基乙基)-7-(3-甲基-2-丁烯基)苯并呋喃-5-基]丙烯酸的OB值较高,β-谷甾醇、茵陈黄酮、异茵陈蒿黄酮的DL值较高 。见表1。

表1 茵陈有效活性成分的基本信息

2.2 茵陈有效活性成分的作用靶点及茵陈治疗AP的相关靶点 经TCMSP筛选得到茵陈有效活性成分的作用靶点共860个,去重后获得茵陈有效活性成分的作用靶点150个。经GeneCards®数据库和OMIM®数据库筛选得到AP相关靶点1 198个,去重后获得AP相关靶点859个。将茵陈有效活性成分的作用靶点和AP相关靶点取交集,得到交集靶点(茵陈治疗AP的相关靶点)81个。见图1和表2。

图1 茵陈有效活性成分的作用靶点和AP相关靶点的韦恩图

表2 茵陈治疗AP的相关靶点

2.3 “中药-活性成分-基因靶点-疾病”网络 使用Cytoscape 3.8.0软件建立“中药-活性成分-基因靶点-疾病”网络图,图中共有96个节点和252条边。96个节点中包括中药类节点1个、有效活性成分类节点13个、靶点类节点81个、疾病类节点1个,见图2。使用Network Analyzer对网络图进行拓扑学分析,结果显示,在活性成分类节点中,槲皮素(度值=79,介数值=0.417 0)、异鼠李素(度值=13,介数值=0.009 9)、β-谷甾醇(度值=11,介数值=0.007 9)、3′,4′,5′-三羟基-6,7-二甲氧基黄酮(度值=9,介数值=0.002 7)的度值和介数值较高,其中槲皮素的度值和介数值均明显大于其余药物活性成分;在靶点类节点中,前列腺素内过氧化物合酶(prostaglandin-endoperoxide synthase,PTGS)2(度值=14,介数值=0.039 4)、热休克蛋白90α家族A类成员1(heat shock protein 90 alpha family class A member 1,HSP90AA1 ;度值=13,介数值=0.035 8)、PTGS1(度值=10,介数值=0.022 1)、丝氨酸蛋白酶1(serine protease 1,PRSS1;度值=10,介数值=0.024 3)的度值和介数值较高,表明这些靶点在茵陈治疗AP中起到重要作用。

图2 “中药-活性成分-基因靶点-疾病”网络图

2.4 PPI网络图 将茵陈治疗AP的相关靶点导入STRING数据库,获得PPI网络图,见图3。运用R语言对靶点蛋白进行信息整合并绘制成图,结果显示,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(serine/threonine kinase 1,AKT1)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、转录因子AP-1亚基(transcription factor AP-1 subunit,JUN)、白细胞介素(interleukin,IL)-6、Caspase-3的连接数目较多,分别连接88个、80个、74个、72个、64个蛋白,见图4。说明以上靶点蛋白在PPI网络中具有重要作用,可能是茵陈治疗AP的重要靶点蛋白。

图3 茵陈治疗AP相关靶点的PPI网络图

图4 茵陈治疗AP的重要靶点蛋白(横轴表示连接数目)

2.5 茵陈治疗AP相关靶点的GO功能富集分析结果 根据富集显著程度由高至低对GO功能富集分析的生物过程、细胞组分、分子功能进行排序,选取前10个条目进行展示。其中生物过程涉及对氧化应激的反应、细胞对化学应激的反应、对活性氧簇的反应、对辐射的反应及细胞对氧化应激的反应、对脂多糖的反应等;细胞组分涉及膜筏、膜微区、RNA聚合酶Ⅱ转录调节复合体、质膜穴样内陷等;分子功能涉及DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、泛素样蛋白连接酶结合、细胞因子受体结合、泛素蛋白连接酶结合、转录辅助调节因子结合等。见图5。

图5 茵陈治疗AP相关靶点的GO功能富集分析柱状图

2.6 茵陈治疗AP相关靶点的KEGG通路富集分析结果 通过KEGG通路富集分析共获得152条信号通路,根据富集显著程度由高至低对152条信号通路进行排序,富集显著程度位于前20的信号通路见图6。茵陈治疗AP相关靶点涉及的信号通路主要为脂质与动脉粥样硬化、流体剪切应力与动脉粥样硬化、乙型肝炎、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体(advanced glycation end-products/receptor of advanced glycation end-products,AGE/RAGE)信号通路、人巨细胞病毒感染、丙型肝炎、EB病毒感染、IL-17信号通路等。

图6 茵陈治疗AP相关靶点的KEGG通路富集分析气泡图

3 讨 论

经检索共获得茵陈有效活性成分13个,包括β-谷甾醇、茵陈黄酮、柳穿鱼黄素等。β-谷甾醇属甾体类化合物,具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗凋亡等作用[10]。陈铁民等[11]研究发现,β-谷甾醇可以减轻幽门螺杆菌感染性胃炎小鼠胃组织炎症反应,表明β-谷甾醇具有抗炎作用,其机制可能与Toll样受体2/核因子κB信号通路相关。茵陈中的黄酮类化合物通常具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理活性[12-13]。研究表明,茵陈黄酮对炎症等引起的疼痛具有缓解作用,且抗氧化及镇痛作用显著[14]。柳穿鱼黄素是一种黄酮类化合物,具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等药理作用,目前柳穿鱼黄素的相关研究多集中于抗肿瘤效果的分析[15]。

“中药-活性成分-基因靶点-疾病”网络图显示,在活性成分类节点中,槲皮素、异鼠李素、β-谷甾醇及3′,4′,5′-三羟基-6,7-二甲氧基黄酮的度值和介数值较高,其中槲皮素的度值及介数值明显大于其余药物活性成分。槲皮素为黄酮醇类化合物,存在于多种植物,具有去除氧自由基、抗炎等作用[16]。研究显示,采用槲皮素干预铃蟾素诱导的小鼠AP模型,小鼠的血清淀粉酶含量、胰腺重量、胰腺病理损伤程度低于或轻于对照组(生理盐水干预)小鼠[17],表明槲皮素能够显著缓解AP症状的严重程度。

AP的主要特征是胰酶致胰腺自身消化,引起胰腺腺泡细胞发生自噬、凋亡,并且伴有严重的炎症反应,炎症细胞和胰腺腺泡细胞随后释放多种炎症介质,其中包括促炎性细胞因子,如IL-6、IL-1、TNF-α等,这些因子水平上升使得血管通透性升高、白细胞活化、组织破坏等,而炎症介质的释放是AP发病的关键因素,且可加重AP病情,导致胰腺外器官受损[18-19]。在本研究中,PPI网络图显示AKT1、TNF、JUN、IL-6、Caspase-3等可能是茵陈治疗AP的重要靶点。其中,IL-6、TNF参与炎症的发生和发展,促进B淋巴细胞成熟,加重胰腺炎症反应[20]。有研究表明,在小鼠发生AP后的初始阶段,AKT1-/-小鼠腺泡细胞受损程度与野生型AP小鼠相似,而随着AP的进展,AKT1-/-小鼠胰腺中的炎症细胞浸润减少,这说明AKT1可以促进炎症反应,推测AKT1可通过激活核因子-κB信号通路参与炎症反应[21]。JUN表达于多种炎症细胞,可促进炎症反应的发生[22]。

GO功能富集分析结果显示,茵陈治疗AP相关靶点涉及的生物过程主要有对氧化应激的反应、细胞对化学应激的反应、对活性氧簇的反应、对辐射的反应及细胞对氧化应激的反应、对脂多糖的反应等;涉及的细胞组分主要有膜筏、膜微区、RNA聚合酶Ⅱ转录调节复合体、质膜穴样内陷等;涉及的分子功能主要有DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、泛素样蛋白连接酶结合、细胞因子受体结合、泛素蛋白连接酶结合、转录辅助调节因子结合等。KEGG通路富集分析结果显示,茵陈治疗AP的作用机制与脂质与动脉粥样硬化、流体剪切应力与动脉粥样硬化、乙型肝炎、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、人巨细胞病毒感染、丙型肝炎、EB病毒感染、IL-17信号通路等信号通路有关。其中,IL-17为重要的信号通路,与炎症反应有关。IL-17还是一种重要的促炎性细胞因子,由Th、γδT淋巴细胞和自然杀伤细胞分泌,在有效的免疫应答过程中起关键作用[23]。机体发生AP时,胰腺自身消化引起的细胞损伤可诱导CD4+Th聚集,分泌IL-17,加重炎症反应。目前已有研究表明IL-17与AP的发生有关,且与器官衰竭的严重程度相关,建议将IL-17作为AP的预测标志物[24]。临床研究显示,IL-17水平可随AP病情的加重而升高,可能与AP的严重程度相关,可以作为评估AP患者病情严重程度的因素[25]。

综上所述,茵陈治疗AP具有多成分、多靶点、多途径的特点,茵陈中的β-谷甾醇、茵陈黄酮、柳穿鱼黄素等有效活性成分可能通过IL-17信号通路、TNF信号通路等信号通路,作用于AKT1、TNF、JUN等关键靶点而起到治疗AP的作用。这为今后深入研究茵陈治疗AP的作用机制提供了思路,但相关结论仍需要更多的基础实验及临床试验加以验证。