急性脑梗死患者血清miR-29c-3p、MDM2水平与预后的关系

张蕊,张志勇,张晋霞,任伯

急性脑梗死(acute cerebral infarction,ACI)由脑血管血流供应突然中断引起,是全球致残事件的主要原因,其发病率随着社会老龄化的发展而不断升高[1-2]。尽早识别ACI、评估患者病情是制定个性化治疗的前提,对患者的恢复和预后具有重要的临床和社会价值。溶栓是ACI常用的治疗方法,然而,溶栓虽可有效疏通血管,但仍存有一定的风险,且不适用于部分大血管闭塞的患者[3-4]。即使在适当的治疗窗进行了溶栓治疗,其预后仍需密切关注[5]。因此,寻找更好的评估ACI预后的血液生物标志物具有重要临床价值。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类非编码短链RNA,通过其靶蛋白调控作用参与癌症及心脑血管等多种疾病的发生、发展[6]。据报道,微小RNA-29c-3p(miR-29c-3p)低表达不仅提示缺血性脑卒中疾病严重程度较高,且是患者短期预后不良的危险因素[7]。鼠双微体2(murine double minute 2,MDM2)是一种原癌基因,在多种人类癌症中发挥致癌活性[8]。此外,MDM2已被证明可通过改变神经元中的氧化还原稳态参与调控大鼠缺血再灌注损伤[9]。生物学研究预测,miR-29c-3p和MDM2可能存在靶向关系,然而,miR-29c-3p和MDM2表达在ACI中的作用尚不清楚。因此,现分析ACI患者血清miR-29c-3p、MDM2表达情况及其与预后的关系,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2021年7月—2022年7月华北理工大学附属医院收治的ACI患者90例为ACI组,其中男54例,女36例,年龄49～70(57.52±6.48)岁。同期医院健康体检者90例为健康对照组,其中男56例,女34例,年龄47～69(56.50±6.20)岁。2组性别、年龄、体质量指数(BMI)、吸烟史、空腹血糖(FPG)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平比较差异无统计学意义(P>0.05);与健康对照组比较,ACI组饮酒史比例、总胆固醇(TC)、高敏C反应蛋白(hs-CRP)水平升高(P<0.05),高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、尿酸(UA)水平降低(P<0.05),见表1。本研究经医院伦理委员会批准(LS2021027),全部受试者及家属知情同意并签署知情同意书。

表1 健康对照组和ACI组临床资料比较

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准:①患者均符合ACI诊断标准[10],且经影像学诊断确诊;②急性发作,发病到入院时间<72 h;③临床数据完整,且患者均接受随访。(2)排除标准:①既往有ACI病史;②有静脉溶栓或发病后血栓清除史;③任何其他中枢神经系统疾病,如颅内出血、帕金森病或阿尔茨海默病等;④严重心脏病、肺部或其他感染性疾病;⑤癌症、自身免疫系统疾病或严重的肝肾功能障碍。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 血生化指标检测:采集ACI患者入院后24 h内、健康者体检时空腹肘静脉血10 ml,离心留取血清,储存于-70℃冰箱。取血清样本,解冻后采用全自动生化分析仪(型号Chemray800,购自北京泽平科技有限责任公司)检测FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C、SCr、BUN、UA。采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清hs-CRP水平,试剂盒购自广州宏新生物技术有限公司。

1.3.2 荧光定量PCR法检测血清miR-29c-3p水平:使用RNA提取试剂盒(购自广东固康生物科技有限公司) 提取血清总RNA,逆转录试剂(购自北京泽平科技有限责任公司)对总RNA进行逆转录合成cDNA。随后,采用PCR试剂盒(购自广东固康生物科技有限公司)进行扩增,反应体系和反应参数根据试剂盒说明书进行,2-ΔΔCt法计算miR-29c-3p水平。引物由安徽佰欧晶医学科技有限公司合成。miR-29c-3p上游引物:5'-GAAGCACCATTTGAAATCAG-3' 和下游引物5'-TTGGCACTAGCACATT-3';内参(U6)上游引物:5'-CTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'和下游引物5'-GCTTCGGCAGCACATATAC-3'。

1.3.3 ELISA法检测血清MDM2水平:采用ELISA法测定血清MDM2水平,试剂盒购自英国Biorbyt公司,于酶标仪(型号CMax Plus,购自上海实维实验仪器技术有限公司)450 nm处读取吸光度值,根据标准曲线计算血清MDM2水平。

1.3.4 生物信息学评估miR-29c-3p和MDM2结合位点:经Starbase数据库(https://starbase.sysu.edu.cn)对miR-29c-3p和MDM2相互作用位点进行预测。

1.3.5 预后评估:患者出院后3个月进行门诊复诊(3个月内无患者死亡),采用改良Rankin量表(mRS)[11]评估患者3个月后神经功能恢复情况。mRS评分以2分为界值,将患者分为预后良好亚组55例(mRS评分≤2分)和预后不良亚组35例(mRS评分>2分)。

2 结 果

2.1 2组血清miR-29c-3p、MDM2水平比较 与健康对照组比较,ACI组血清miR-29c-3p水平降低,MDM2水平升高(P<0.01),见表2。

表2 健康对照组和ACI组血清miR-29c-3p、MDM2水平比较

2.2 ACI患者2亚组血清miR-29c-3p、MDM2水平比较 与预后良好亚组比较,预后不良亚组血清miR-29c-3p水平降低,MDM2水平升高(P<0.01),见表3。

表3 预后良好亚组和预后不良亚组ACI患者血清miR-29c-3p、MDM2水平比较

2.3 ACI患者血清miR-29c-3p、MDM2水平的相关性分析 miR-29c-3p与MDM2有靶向作用位点,见图1。经Pearson法分析,ACI患者血清miR-29c-3p与MDM2水平呈负相关(r=-0.442,P<0.001)。

图1 miR-29c-3p与MDM2的靶向作用位点

2.4 影响ACI患者预后不良的多因素Logistic回归分析 以ACI患者预后情况为因变量,以上述结果中有统计学意义的指标(饮酒史、TC、HDL-C、UA、hs-CRP、miR-29c-3p、MDM2)作为自变量纳入多因素Logistic回归分析,结果发现,血清hs-CRP高水平、MDM2高水平是ACI患者预后不良的独立危险因素(P<0.05),miR-29c-3p高水平是其保护因素(P<0.05),见表4。

表4 Logistic回归分析ACI患者预后不良的影响因素

2.5 血清miR-29c-3p、MDM2预测ACI患者预后不良的价值 绘制血清miR-29c-3p、MDM2 预测ACI患者预后不良的ROC曲线,并计算曲线下面积(AUC),结果显示,血清miR-29c-3p、MDM2及二者联合预测ACI患者预后不良的AUC分别为0.825、0.831、0.909,二者联合预测效能优于单项预测(Z/P=2.222/0.026、2.063/0.039),见图2、表5。

表5 血清miR-29c-3p、MDM2及二者联合对ACI患者预后不良的预测价值

3 讨 论

ACI可导致严重的脑损伤,影响患者的健康和生活质量[12]。研究显示,ACI过程中一些miRNA表达会随着疾病进展而变化,有望作为疾病的潜在预测指标或新的治疗方向[13-14]。Song等[15]研究表明,血浆miR-409-3p在ACI中高表达,升高的血浆miR-409-3p与疾病严重程度相关。骆嵩等[16]研究显示,miR-34c水平可评估ACI患者炎性反应和神经缺损的严重程度。miR-29c-3p是近期发现的一种可参与缺血性脑病发展的miRNA[7]。以往研究显示,miR-29c-3p过表达可通过靶向抑制10-11易位蛋白2介导帕金森疾病模型小鼠中的自噬,进而改善疾病的发展[17],表明高水平miR-29c-3p对帕金森疾病的进展具有抑制作用。在本研究中,ACI患者血清miR-29c-3p水平较健康者低,与Wang等[17]研究结果类似,提示低表达的miR-29c-3p可能影响ACI的发生。Zhang等[18]研究发现,miR-29c-3p是脓毒症患者心功能不全发生的独立危险因素,在动物模型中抑制miR-29c-3p表达可降低脓毒症引起的心脏功能障碍和炎性反应。提示miR-29c-3p在不同的疾病中发挥的功能不尽相同。随后评估了miR-29c-3p水平与ACI预后的关系,结果显示,预后不良ACI患者血清miR-29c-3p水平较预后良好ACI患者更低,提示血清中miR-29c-3p低水平可能为ACI预后不良的早期指标。进一步研究发现,血清miR-29c-3p低水平为ACI患者预后不良的独立危险因素,在临床中有望使用miR-29c-3p水平对其预后进行评估。

Starbase网站预测miR-29c-3p可能与MDM2存在靶向关系。同时相关性分析证实,ACI患者血清miR-29c-3p与MDM2水平呈负相关,与网站预测的结果相一致。MDM2是肿瘤抑制因子p53的负调节因子,在多种恶性肿瘤中高表达[19-20]。早期研究表明,MDM2可通过调节心肌梗死小鼠核因子-κB通路减轻心功能不全和纤维化[21]。胡雪钟等[22]研究证实,下调MDM2可通过影响p53通路减轻缺血性脑卒中的发展。然而,尚未有研究表明MDM2在ACI中的作用。本研究结果显示,ACI患者血清MDM2水平较健康者高,预后不良ACI患者血清MDM2水平较预后良好ACI患者高,与胡雪钟等[22]研究结果一致,验证了高水平MDM2可促进缺血性脑病的进展。并且血清MDM2高水平是ACI患者预后不良的独立危险因素,表明MDM2水平可能与ACI的预后不良有关,可能作为预测ACI预后的潜在标志物。通过构建ROC曲线发现血清miR-29c-3p、MDM2水平对ACI患者预后不良具有较高的预测价值,并且二者联合预测的AUC和特异度上升,表明二者均有望成为ACI预后的预测因子。hs-CRP是一种常见的非特异性炎性因子,据报道,血清hs-CRP高水平是ACI预后不良的独立危险因素[23],与本研究结果一致。可能是因为hs-CRP能与脂蛋白结合,激活经典补体途径,直接增强静息血管内皮细胞,介导内皮细胞中白细胞的滚动、吸附和渗出,形成不稳定斑块,最终诱发缺血性脑卒中[24]。因此,本试验结果可能是miR-29c-3p与MDM2相互作用,炎性因子累积,导致ACI的不良预后,具体机制还需进一步研究。

综上,ACI患者血清miR-29c-3p呈低水平,MDM2呈高水平,且预后不良ACI患者血清miR-29c-3p较预后良好患者更低,MDM2水平较预后良好患者更高,二者联合对ACI患者预后有较高预测价值。然而本研究为单中心研究,且样本量不大,后续将进行大规模、多中心的研究以进一步完善该结论在多样化ACI群体中的适用性。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

张蕊:设计研究方案,实施研究过程,论文撰写;张志勇:提出研究思路,分析试验数据,论文审核;张晋霞:实施研究过程,资料搜集整理,论文修改;任伯:进行统计学分析