超高效液相色谱法同时测定红芪和黄芪药材中有效成分含量*

焦 洁，郭建博，郑 旭，胡萌萌，蔡 虎

（陕西省食品药品检验研究院·国家药品监督管理局药品微生物检测技术重点实验室，陕西西安 710065）

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. var. mongholicus（Bge.）Hsiao 或膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge 的干燥根，是内蒙古和甘肃道地药材。红芪为豆科植物多序岩黄芪Hedysarum polybotrysHand. - Mazz. 的干燥根，是甘肃道地药材。二者为同科不同属药材，均有补气升阳、利水消肿、止汗、托毒排脓及敛疮生肌功效［1］，但主要成分及药理作用存在差异。在皂苷类和黄酮类成分方面，黄芪、红芪分别已分离出125，21个化合物。黄芪主要有细胞免疫、降血糖、保护心脑血管、改善肾功能等作用，红芪主要有抗骨质疏松、抗肿瘤、抗炎等作用，且二者均有抗免疫、抗衰老、免疫调节等药理作用［2-4］。目前，红芪的相关研究报道和临床应用远少于黄芪。本研究中探讨了红芪、黄芪药材的共有成分和特有成分，为二者的对比分析及红芪药材的推广提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters H-Class型超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；SK5200GT 型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；MS430TS 型电子天平、XPE205 型电子天平（梅特勒-托利多仪器<上海>有限公司）；Merck Milli-Q超纯水仪（默克化工技术<上海>有限公司）；DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试药

毛蕊异黄酮对照品（批号为DST190915012，含量≥98%），芒柄花苷对照品（批号为DST190711044，含量≥98%），均购于成都德斯特生物技术有限公司；毛蕊异黄酮苷对照品（批号为111920 - 201505，含量≥97.1%），阿魏酸对照品（批号为110773 -201614，含量≥99%），异阿魏酸对照品（批号为111698-201103，含量≥99.2%），香草酸对照品（批号为110776-201503，含量≥99.8%），均购于中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水；蒙古黄芪（陇海药材有限责任公司，批号为120974 - 202011），武都红芪（陇南同人红芪购销有限责任公司，批号为20200805），均经陕西中医药大学中药资源教研室王西芳教授鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters BEH C18柱（200 mm × 2.1 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈（A）- 0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～1 min 时8%A→13% A，1～10 min 时13%A，10～15 min 时13%A→20%A，15～18 min 时20%A→23%A，18～23 min 时23%A →20%A，23～25 min 时20%A→13%A，25～27 min 时13%A→8%A）；流速：0.2 mL/min；检测波长：250 nm；柱温：35 ℃；进样量：1 μL。

2.2 溶液制备

取香草酸、阿魏酸、异阿魏酸、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷对照品各适量，精密称定，用甲醇制成质量浓度分别为403.19，436.59，466.24，488.04，400.82，404.91 μg/mL 的混合对照品溶液。取红芪、黄芪药材样品粉末各3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30 mL 甲醇，超声（功率250 W，频率43 kHz）处理30 min，取出，滤过，用甲醇少量多次冲洗残渣，浓缩，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，经0.2 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液Ⅰ和Ⅱ［4］。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：取2.2项下溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱中，在与混合对照品溶液色谱相同保留时间处有相应色谱峰，表明方法系统适用性良好。详见图1。

图1 超高效液相色谱图1.Vanillic acid 2.Ferulic acid 3.Calycosin-7-glucoside 4.Isoferulic acid 5.Ononin 6.Calycosin A.Mixed reference solution B.Test solution Ⅰ C.Test solution ⅡFig.1 UPLC chromatograms

线性关系考察：分别精密吸取2.2项下混合对照品溶液各适量，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，得系列混合对照品溶液；取适量，按2.1 项下色谱条件进样测定，以待测成分质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，结果见表1。

表1 线性关系及定量限、检测限考察结果Tab.1 Results of the linear relation test，limit of quantitation and limit of detection

检测限与定量限考察：取2.2项下混合对照品溶液适量，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以信噪比（S/N）为3 和10 时的待测成分质量浓度为检测限和定量限，结果见表1。

精密度试验：精密吸取2.2项下混合对照品溶液适量，按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果香草酸、阿魏酸、毛蕊异黄酮苷、异阿魏酸、芒柄花苷、毛蕊异黄酮峰面积的RSD分别为1.21%，0.83%，0.52%，0.76%，0.65%，1.02%，均小于2.0%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2项下供试品溶液适量，按2.1项下色谱条件分别于0，2，4，6，8，10，12，24 h时进样测定，记录峰面积。结果前述6种成分峰面积的RSD分别为2.02%，2.63%，4.81%，4.54%，3.18%，4.36%，均小于5.0%（n=8），表明供试品溶液室温下放置24 h内基本稳定。

重复性试验：称取同一批红芪药材样品3 g，各6 份，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果前述6种成分含量的RSD分别为3.05%，3.32%，2.12%，2.73%，2.56%，3.55%，均小于5.0%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取同一批已知含量的红芪药材样品约1.5 g，精密称定，平行6 份，置具塞锥形瓶中，加入一定质量浓度的混合对照品溶液，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.4 样品含量测定

取红芪、黄芪药材样品各适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，计算各待测成分含量，结果见表3（-为未测出）。可见，黄芪、红芪药材的3 种共有成分含量差异较大，黄芪药材中毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮含量约分别为红芪药材的16 倍和5 倍，红芪药材中芒柄花苷含量约为黄芪药材的4倍。

表3 药材样品含量测定结果（μg/g，n=3）Tab.3 Results of content determination of six components in medicinal material samples（μg/g，n=3）

3 讨论

3.1 样品处理

黄芪与红芪药材样品的提取一般多采用回流提取法，部分采用萃取法，并应用蒸发光检测器测定［5］。预试验中考察了甲醇（回流法、超声法）提取、乙醇（回流法、超声法）提取，发现以甲醇为溶剂的提取效果较佳，加热回流提取法和超声提取法的提取效果相差不大。考虑到超声提取操作简单，溶剂损耗少、耗费时间短，故选择甲醇超声提取；同时考察了提取温度、提取时间、提取次数对提取效果的影响，结果当提取温度为25 ℃、提取时间为30 min、提取1 次时，提取效果最佳。

3.2 检测波长选择

通过查阅相关文献及UPLC 全波长色谱扫描图谱分析，测得红芪药材中有机酸类及黄酮类成分的最佳检测波长分别约为280，250，230 nm［6-8］。通过对比分析，红芪药材有效成分在250 nm 波长处峰形较好、分离度及响应度也较高，故以250 nm为检测波长。

3.3 样品含量测定

本研究结果显示，红芪、黄芪药材的共有成分为芒柄花苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷。黄芪药材中毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷的含量显著高于红芪药材，红芪药材中芒柄花苷含量显著高于黄芪药材。文献［9］显示，黄芪药材中各黄酮类成分含量均高于红芪药材，与本研究结果存在差异，分析原因可能为各药材产地、采收年限、生长环境、生产加工等存在差异［10-12］，但该差异不影响药材对比研究方法的确定。

3.4 图谱分析

本研究结果显示，在同一色谱条件下可同时测定红芪药材中香草酸、阿魏酸、异阿魏酸、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷6种有效成分及黄芪药材中芒柄花苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷3种成分的含量，且峰形较好、分离度较高，表明此色谱条件可用于2 种药材的单指标及多指标成分对比分析。且黄芪药材样品中其余色谱峰峰形也较好，后期可作进一步研究。

本研究可为相近种属药材成分的对比研究提供研究思路，可采用同一条件进行单一药材多成分研究与2 个及以上药材多指标成分对比研究，研究范围相对广泛。本研究中对黄芪与红芪药材的有效成分进行了定量比较研究，以期为二者的临床应用提供理论依据，以更好地促进和推动中药黄芪和红芪资源的合理利用［13-16］。

综上所述，本研究中所建立的方法可靠，操作简单，可为后期红芪及黄芪药材的质量控制提供参考。