刺山柑对类风湿关节炎大鼠滑膜组织自噬相关蛋白表达的影响

丁霞　昂沙尔?毕哈孜　霍新慧

摘要 目的：观察刺山柑果风湿止痛贴对类风湿关节炎大鼠滑膜组织自噬相关蛋白表达的影响，并探究刺山柑治疗类风湿关节炎（RA）的可能作用机制。方法：将40只无特定病原体（SPF）级SD大鼠采用随机数字法分为正常组，模型组，阳性药组和刺山柑组，每组10只，对造模的大鼠在足跖底部注射0.1 mL完全弗氏佐劑。模型组、阳性药组和刺山柑组分别于大鼠左后足跖部外敷空白凝胶、伤湿止痛膏以及刺山柑果风湿止痛贴，每组持续干预21 d。观测关节炎（AI）指数和足爪容积的指标，酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测大鼠血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平，蛋白质印迹法检测滑膜组织中微管相关蛋白轻链3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）、Beclin蛋白复合物-1（Beclin-1）蛋白表达。结果：与正常组比较，模型组和阳性药组LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达均上升（P<0.05，P<0.01），刺山柑组LC3-Ⅱ蛋白表达降低（P<0.01），Beclin-1蛋白表达升高（P<0.01）；与模型组比较，阳性药组Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表达差异无统计学意义，刺山柑组LC3-Ⅱ蛋白表达降低（P<0.01），Beclin-1蛋白表达升高（P<0.01）。结论：刺山柑果风湿止痛贴治疗AA大鼠比伤湿止痛膏疗效更加显著，从而为刺山柑治疗RA提供一定的科学依据，其相关机制可能与蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1表达有关。

关键词 类风湿关节炎；刺山柑；佐剂性关节炎大鼠；自噬；肿瘤坏死因子-α；蛋白表达；微管相关蛋白轻链3-Ⅱ；Beclin蛋白复合物-1

Effect of Capparis spinosa on the Expression of Autophagy-related Proteins in Synovial Tissues of Rats with Rheumatoid Arthritis

DING Xia，Angshaer Bihazi，HUO Xinhui

（College of Traditional Chinese Medicine，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China）

Abstract Objective：To observe the effect of Capparis spinosa fruit paste on the expression of autophagy-related proteins in synovial tissues of rats with rheumatoid arthritis，and to explore the possible mechanism of C.spinose in RA.Methods：Forty SPF rats were randomly divided into a normal group，a model group，a positive drug group，and a C.spinose group，with 10 rats in each group.The rats to be modeled were injected with 0.1 mL complete Freund′s adjuvant at the foot bottom.The model group，positive drug group，and C.spinose group externally applied blank gel，Shangshi Zhitong Ointment，and C.spinosa fruit paste，respectively，on the left posterior plantar of rats for 21 d.Arthritis index（AI） and paw volume index were measured.The level of serum tumor necrosis factor-α（TNF-α） was detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），and the protein expression of microtubule-associated protein light chain 3-Ⅱ（LC3-Ⅱ） and Beclin-1 in synovial tissues was detected by Western blot.Results：As compared with the normal group，the protein expression of LC3-Ⅱ and Beclin-1 in the model group and positive drug group was increased（P<0.05，P<0.01），and that of LC3-Ⅱ was decreased（P<0.01） while Beclin-1 was increased（P<0.01） in the C.spinose group.As compared with the model group，the protein expression of Beclin-1 and LC3-Ⅱ in the positive drug group had no significant difference，while that of LC3-Ⅱ was decreased（P<0.01） and Beclin-1 protein was increased（P<0.01） in the C.spinose group.Conclusion：C.spinosa fruit paste is more effective in the treatment of rats with RA than Shangshi Zhitong Ointment，thus providing a scientific basis for the treatment of RA by C.spinosa，and the related mechanism may be related to the expression of LC3-Ⅱ and Beclin-1.

Keywords Rheumatoid arthritis; Capparis spinosa; Rats with adjuvant arthritis; Autophagy; Tumor necrosis factor-α; Protein expression; microtubule-associated protein light chain 3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）; Beclin-1

中图分类号：R245.81；R29文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2023.02.006

类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种不可治愈的自身免疫疾病，以关节、骨发生炎症为主要特征，其症状通常为关节疼痛、肿胀，甚至身体功能会被严重损害［1］。自噬（Autophagy）是细胞回收细胞质成分产生能量的降解机制［3］。研究发现，自噬是RA发病的相关机制之一，自噬可能参与了RA滑膜成纤维细胞对凋亡诱导的抵抗，其与破骨细胞生成有关［4］。刺山柑（Capparis Spinosa L）作为经典的新疆地方药材在临床和民间用来治疗风湿及RA已有悠久的历史［5］。刺山柑主要生长于荒漠戈壁之中，在我国主要产于西北干旱地区，新疆的沙漠地区分布最为广泛，其用药部位大多为果实和根皮，分布于世界各个国家［6］。本实验用刺山柑果风湿止痛贴治疗佐剂型关节炎（Adjuvant Arthritis，AA）大鼠，观察其对RA自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链-3-Ⅱ（Microtubule-associated Protein Light Chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）、Beclin蛋白复合物-1（Beclin-1）的影响，探讨细胞自噬与RA发病机制的关联，为该药治疗RA的提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取40只无特定病原体（Specific Pathogen Free，SPF）级8周龄维斯塔尔（Wistar）大鼠购买并饲养在新疆医科大学动物实验中心，雌雄各半，体质量160～200 g，实验动物生产许可证号：SYXK（新）2016-0002；动物房湿度和温度分别控制在55%～60%和20～24 ℃左右，大鼠随意饮食和进水；12 h光照，昼夜循环。该研究通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会审批（伦理审批号：20180223-136）。

1.1.2 药物 刺山柑果风湿止痛贴（新疆医科大学中医学院中药系提供，批号：20161022）；伤湿止痛膏（黄石市力康药业有限公司，批号：20170100）。

1.1.3 试剂及仪器 完全弗氏佐剂（Complete Freund′s Adjuvant，CFA）（Sigma公司，美国，批号：SLBW7430）；肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）的试剂盒（Cusabio公司，美国，批号：G22018349）；LC3-Ⅱ试剂盒（Abcam公司，英国，批号：GR3201455-1）；Beclin-1试剂盒（Abcam公司，英国，批号：GR3204186-1）；磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH，Abcam公司，英国，批号：GR3249122-1）；多功能酶标仪（TECAN公司，瑞士，型号：Infinite M200 Pro）；通用型电泳仪（BIO-RAD Serial公司，美国，型号：042BR11250）；电泳槽（BIO-RAD Serial公司，美国，型号：552BR071035）；转印槽（BIO-RAD Serial公司，美国，型号：49BＲ36704）；微型离心机（六一仪器厂，型号：WD-2105A）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将40只大鼠适应性饲养3 d后，按编号采用随机数字法分为10只正常组和30只进行模型制备。用75%乙醇于大鼠左后足跖内消毒并皮内注射完全弗氏佐剂0.1 mL/只致炎，建立AA大鼠模型。造模3 d后大鼠左足趾肿胀度根据关节炎指数（Arthritis Index，AI）积分法评定［7］：无关节红肿计0分；足趾关节红肿计1分；趾关节和足趾肿胀计2分；踝关节以下红肿计3分；全部足爪（包括踝关节在内）肿胀计4分。AI值即每只大鼠四肢评分分数之和。评分达到6分以上即为造模成功。将30只模型大鼠按随机数字表分为3组：模型组、阳性药组、刺山柑组。

1.2.2 干预方法 依照本课题组前期经验［8］，在成功造模后4 h，刺山柑组给予左后足跖以刺山柑果风湿止痛贴［30 cm2/（kg·d）］经皮给药；阳性药组和模型组给予同样部位和方式分别以伤湿止痛膏［15 cm2/（kg·d）］、空白凝胶给药，4 h/次，1次/d，连续给药21 d。空白组正常饲养，无任何干预。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 一般状态 每天对大鼠的体质量、精神状态、活动情况、饮食以及饮水量、大小便等一般情况进行观察并做好相应记录。

1.2.3.2 AI指数 各组大鼠按照1.2.2操作方法于造模成功和治療结束后进行AI评分。

1.2.3.3 足爪容积 于造模后和各个疗程之后结束后测量足爪容积，在AA大鼠同一定位做浸水标记线，用排水法原理测量足爪容积，每只足爪测量2次取平均值。

1.2.3.4 酶联免疫吸附试验法检测大鼠血清TNF-α水平 大鼠治疗21 d后统一处理，将各组大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉后，腹主动脉采血并做相应记号，并放置于室内1 h后离心。离心半径10 cm，以17 000 r/min转速，在4 ℃环境中，离心10 min，取上清液放入EP管内然后-20 ℃保存。严格按照试剂盒说明书逐步操作。

1.2.3.5 蛋白质印迹法检测大鼠滑膜自噬相关蛋白的表达水平 将处死后的大鼠的踝关节剥离并放入4%多聚甲醛固定液中保存。滑膜组织常规病理切片，脱蜡至水，按照蛋白质印迹法检测大鼠滑膜组织LC3-Ⅱ、Beclin-1的表达量，内参为GAPDH。取大鼠滑膜组织用冰研磨，然后离心分离取上清液，蛋白量的测定使用二喹啉甲酸（Bicinchoninic Acid，BCA）蛋白质试剂盒；依次加样、凝胶电泳、转膜和室温封闭；按抗体说明书加入一抗LC3-Ⅱ（1∶3 000）、Beclin-1（1∶3 000）、置4 ℃冰箱过夜，洗膜，再加入二抗（1∶10 000），增强化学发光法（Enhanced Chemiluminescence，ECl）显色;放于凝胶图像成像分析系统，曝光其蛋白条带。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间方差齐性用最小显著差异法（LSD），方差不齐性用Dunnett T3检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况的影响 模型制备成功AA大鼠每日无精打采、食欲不振、体质量下降，足部出现明显红肿，左后肢足跖部最严重，同时也伴有部分四肢轻微红肿。阳性药组和刺山柑组大鼠经治疗后精神和活动度等均有明显改善，食量和体质量均有增长。

2.2 AI和足爪容积的变化 与正常组比较，其余3组大鼠造模后，其AI和足爪容积指标均明显上升（P<0.01）；与模型组比较，阳性药组和刺山柑组大鼠经治疗后，其AI和足爪容积指标均显著降低（P<0.05或P<0.01）。见表1。

2.3 各组血清TNF-α水平的变化 与正常组比较，模型组大鼠血清TNF-α水平明显上升（P<0.05）。与模型组比较，阳性药组和刺山柑组TNF-α水平均显著下降（均P<0.05）。见表2。

2.4 滑膜组织LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达的变化 与正常组比较，模型组和阳性药组LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达均升高（P<0.05，P<0.01），刺山柑组LC3-Ⅱ蛋白表达降低（P<0.01），Beclin-1蛋白表达升高（P<0.01）；与模型组比较，刺山柑组LC3-Ⅱ蛋白表达降低（P<0.01），Beclin-1蛋白表达升高（P<0.01）。见表3、图1。

3 讨论

中医学中RA属“痹证”范畴，通常由于先天禀赋不足，外感邪气闭阻经络导致［9］。由于该病发病机制复杂，目前尚没有能够完全治愈的疗法，中医针灸治疗有其独特的优势，能有效地缓解症状，控制病程情［10］。刺山柑作为传统民族药，在新疆地区治疗RA已有悠久的历史，特别是在抗炎镇痛方面疗效确切［11］。本课题组前期已证实刺山柑果风湿止痛贴具有良好的抗炎止痛作用，其机制可能与基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinase，MMPs）表达有关［8］。本实验进一步从自噬角度观察刺山柑果风湿止痛贴对AA大鼠滑膜组织自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1表达的影响，从而为刺山柑治疗RA提供一定的科学依据。

现代医学发现，RA的发病机制与免疫功能紊乱密切相关，通过相应途径启动特意性免疫应答［12］；同时滑膜组织作为关节腔内的膜状非免疫器官，会分泌更多的炎症介质，如TNF-α、白细胞介素-17等［13］。TNF-α不仅能阻断RA的炎症和骨侵蚀，还能诱导RA滑膜成纤维细胞（RA Svnovial Fibroblasts，RASFs）的自噬［14］。RASFs能改变侵袭性和侵袭性表型的信号通路表达，持续性刺激自噬通路，使细胞死亡［15］，造成RASFs增殖和活化，从而导致RA患者关节的慢性炎症和关节破坏［16］。

CFA诱导的AA大鼠模型是最常用的RA模型［17］。AA大鼠模型造模简便、实用性强，主要表现为早期被干预部位的炎症反应，造模成功的大鼠症状和病理改变与RA患者极其相似，所以现已成为研究RA理想模型［18］。

自噬是细胞内的一种“自食”现象，细胞通过降解不必要和功能障碍的自身成分来对损伤做出反应［19］，但这种能力可能会导致细胞死亡，所以，细胞自噬具有双重作用［15］。在哺乳动物细胞中，自噬可分为3种类型，虽然每一种在形态上是不同的，但三者最终都将货物输送到溶酶体进行降解和回收［20］。自噬在免疫系统中具有清除细胞内病原体、分泌途径、促进淋巴细胞发育、促炎信号转导等功能［21］。自噬蛋白是自噬的核心分子，在免疫细胞的分化和维持内环境稳态等免疫过程中发挥作用［22］。LC3和Beclin-1是重要的自噬相关蛋白［23］。

LC3是酵母自噬相关蛋白（Autophagy-related，Atg）8的哺乳动物同源物，存在于自噬溶酶体的降解过程中，被用作监测自噬的特异性标记［24］。诱导自噬后，LC3与磷脂酰乙醇胺结合，并靶向自噬膜，因此，LC3定位的改变被用来衡量自噬［25］。LC3被半胱氨酸蛋白酶Atg4切割，产生细胞溶质形式的LC3-I，在被Atg7激活后，被转移到Atg3，以改变与磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylethnolamine，PE）的缀合形式，命名為LC3-Ⅱ［26］。LC3-Ⅱ是测试自噬活性最常用的标记，是成熟过程中唯一与自噬体稳定相关的蛋白质［25］。Beclin-1是自噬核心复合物的重要组成部分是自噬启动的必要因素，是一种多结构域蛋白质，以正向调节和负向调节的方式促进自噬的调节，与Ⅲ型磷酸肌醇-3-激酶复合体1（Class Ⅲ Phosphatidylinositol-3-kinase（PI3KC3）Complex 1，PI3KC3-C1，）形成复合体，调节其他相关联蛋白表达在自噬前体中的位置，在自噬体的形成过程中举足轻重［27］。

本实验AA大鼠经治疗后阳性药组、刺山柑组AI和足爪容积指标均降低；经治疗后，刺山柑组LC3-Ⅱ蛋白表达显著降低，Beclin1蛋白表达显著升高。

综上所述，AA大鼠经治疗后，阳性药组和刺山柑组大鼠足趾肿胀均有改善，且刺山柑组消肿效果更明显。刺山柑果风湿止痛贴治疗AA大鼠比较伤湿止痛膏疗效更显著，相关结论与本课题组前期研究结果一致，其相关机制可能与抑制大鼠滑膜组织自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达、上调蛋白Beclin1表达有关，但其具体作用机制还有待进一步研究。

利益冲突声明：无。

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（2021-05-24收稿 本文编辑：刘强）

基金项目：国家自然科学基金地区项目（81860890）；新疆维吾尔自治区科技厅面上项目（2017D1C210）作者简介：丁霞（1995.04—），女，硕士研究生在读，研究方向：民族医药治疗免疫系统疾病的机制研究，E-mail：895925213@qq.com通信作者：霍新慧（1981.04—），女，博士，教授，研究方向：民族医药治疗免疫系统疾病的机制研究，E-mail：xjhuoxinhui@126.com