桧木醇对西瓜枯萎病菌的抑制作用

张旭欢, 王阿玲, 李文奎,2, 吴 华,2, 雷 鹏,2,冯俊涛,2, 王 勇*,,2, 马志卿,2

(1.西北农林科技大学 植物保护学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西省生物农药工程技术研究中心，陕西 杨凌 712100)

西瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporumf.sp.niveum，FON) 侵染所引起的土传真菌病害，在西瓜的全生长期均可发病，其中伸蔓期至开花坐果期是感染该病的敏感期[1-2]。幼苗期染病症状通常表现为子叶及真叶失水萎蔫、褪绿坏死直至植株死亡[3]。

图式1 桧木醇结构式Scheme 1 The structural formula of hinokitiol

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 仪器设备 JSM-6360LV 扫描电子显微镜(SEM，日本电子株式会社)；WT5003CH 万分之一电子天平 (常州万泰天平仪器有限公司)；HYC-940 医用冷藏箱 (青岛海尔特种电器有限公司)；ZFD-5140 全自动新型鼓风干燥箱 (上海智城分析仪器制造有限公司)；FE28-Standard pH 计及FE38-Standard 电导率仪 (梅特勒-托利多仪器 (上海) 有限公司)；1525 高效液相色谱仪 (HPLC，美国Waters 公司)；SW-CJ-2FD 超净工作台 (苏州安泰空气技术有限公司)；SPX-250 型智能生化培养箱 (宁波江南仪器厂)；RSB-Ⅲ 循环水式多用真空泵 (郑州长城科工贸有限公司)；MH-LC 52 中高压制备液相一体机 (赛普瑞斯 (北京) 科技有限公司)。

1.1.2 供试病原菌和植物 西瓜枯萎病菌Fusarium oxysporumf.sp.niveum由陕西省生物农药工程技术研究中心提供，于PDA 培养基上4℃保存。

供试植物：西瓜苗 (农科大11 号)。

1.1.3 药剂及培养基 95%多菌灵 (carbendazim)

原药和97%桧木醇 (hinokitiol) 原药，均购于百灵威科技有限公司，分别用0.1 mo/L 的盐酸及甲醇溶解、配制为母液，备用。镰刀菌酸 (fusaric acid，FA) 标准品 (纯度 > 99%) 购于Sigma 公司。

PDA 培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉16 g，用蒸馏水定容至1 L，调pH 值为7.0；PDB 培养液：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，用蒸馏水定容至1 L，调pH 值为7.0；水琼脂培养基 (WA)：琼脂粉40 g，用蒸馏水定容至1 L，取每100 mL分装至一个锥形瓶，封口；蔡氏培养基 (Czapek-Dox Medium)：硝酸钠2 g，磷酸氢二钾1 g，氯化钾10 g，七水合硫酸镁0.5 g，硫酸铁0.01 g，蔗糖30 g，用蒸馏水定容至1 L。培养基均高温高压灭菌后常温保存。

1.2 试验方法

1.2.1 桧木醇对西瓜枯萎病菌的抑制活性测定

1.2.1.1 对菌丝生长的抑制活性 采用菌丝生长速率法[10]测定。将等体积不同浓度的桧木醇与加热融化后的50 mL PDA 培养基混合均匀，制成桧木醇终浓度分别为质量浓度 0、6.25、12.5、25、50 和100 μg/mL 的含药培养基。以不含药剂的培养基作为空白对照。每处理设3 个重复。将西瓜枯萎病菌在PDA 平板上于25℃培养6 d 后，用直径5 mm 的打孔器打取菌饼，分别转接于上述各含药和空白PDA 培养皿中央，置于25℃恒温箱中培养6 d 后，采用十字交叉法测量菌落直径，根据公式 (1) 计算菌丝生长抑制率 (Im，%)。

式 (1) 中：D0为空白对照组菌落直径，mm；Dt为药剂处理组菌落直径，mm。

1.2.1.2 对孢子萌发的抑制活性 采用孢子萌发法[11]测定。取10 块直径5 mm 的菌饼，放入含有100 mL PDB 培养液的锥形瓶中，于25℃、180 r/min 下摇床培养6 d 后，用双层灭菌纱布过滤，将滤液在157g下离心5 min，用无菌水重悬，制得孢子悬浮液。将WA 培养基融化，加入一定浓度的桧木醇药液摇匀，制成桧木醇终浓度分别为质量浓度0、6.25、12.5、25、50 和100 μg/mL 的含药培养基，以不含药剂的WA 平板为空白对照。用无菌水稀释上述孢子悬浮液，配制成在40 倍镜下每视野20 个孢子左右的菌悬液，吸取100 μL 菌悬液于不同浓度含药及空白对照WA 平板上并涂布均匀，每处理3 个重复。将各处理WA 平板密封后置于25 ℃培养箱中黑暗培养，12 h 时取出，置于高倍镜 (1000 倍) 下观察孢子萌发情况：若芽管长度大于孢子短半径即视为萌发，反之则为未萌发。每皿观察3 个视野，每次观察不少于100 个孢子，结果取平均值。依据公式 (2) 计算孢子萌发抑制率 (Is，%)。

式 (2) 中：S0为空白对照组孢子萌发率；St为药剂处理组孢子萌发率。

上述试验数据均采用DPS 标准统计软件进行处理，获得毒力回归方程及有效抑制中浓度(EC50) 值。

1.2.2 桧木醇对西瓜枯萎病的盆栽防治效果测定 将催芽萌发的西瓜种子移至育苗盘中进行壮苗后，选取长势健壮的幼苗移栽至塑料盆中，基质为常规的育苗基质。待培养至两叶一心期时，采用伤根法进行接种，每株浇灌10 mL 孢子悬浮液 (1 ×105/mL)，并将其移至人工气候箱中，在相对湿度90%、温度28 ℃、光照时间12 h/d 的条件下培养。将桧木醇用甲醇稀释，配制成有效成分质量浓度分别为250、500 和1000 μg/mL，并设有效成分质量浓度为500 μg/mL 的多菌灵阳性对照及清水空白对照。接种病原菌24 h后，每株分别浇灌10 mL 桧木醇、多菌灵药液或清水。每处理3 次重复，每次重复10 株，随机区组排列，于施药后14 d 调查发病情况。

采用分级计数法进行病害调查，参照文献方法，将西瓜枯萎病害分为以下5 级[12]：0 级，植株无发病症状；1 级，1 片或2 片子叶轻微发黄，但生长正常；2 级，植株叶片出现黄化，子叶和叶片出现萎蔫；3 级，植株中等发病，叶片出现中等萎蔫；4 级，植株叶片萎蔫，但未枯死；5 级，植株枯死。病情指数及防治效果分别采用公式 (3) 和(4)[12]计算。

式 (3) 中：R为病情指数；Ni为i病级对应的病株数；i为病级数；N为调查总株数。

式 (4) 中：P为防治效果，%；R0为空白对照区病情指数；Rt为药剂处理区病情指数。

1.2.3 西瓜枯萎病菌生理生化指标测定

1.2.3.1 相对电导率测定 将培养6 d 的西瓜枯萎病菌菌株沿菌落边缘打取10 个菌饼，放入100 mL PDB 培养基中，于25℃、180 r/min 摇床培养6 d；用双层纱布过滤收集菌丝，并用灭菌水冲洗2 次，取0.5 g 收集的菌丝样品分别悬浮于含有0 和EC50浓度桧木醇的25 mL 灭菌水中；分别在0、30、60、90、120、150、180、210 和240 min时测定各处理菌悬液电导率，并在240 min 后煮沸菌丝5 min，测定最终电导率。每个处理设3 个重复，按照文献方法计算菌丝的相对电导率[13]。

1.2.3.2 镰刀菌酸含量测定 将西瓜枯萎病菌菌饼转接到含有100 mL 蔡氏培养基的250 mL 锥形瓶中，每瓶10 个菌饼，于25℃、180 r/min 摇床培养6 d。分别添加不同浓度 (0、EC50、EC70、EC90) 的桧木醇后继续摇床培养8 d，得到混悬液。将混悬液于2683g离心10 min，取上清液，用2 mol/L HCl 溶液调pH 值至2.5，以相同体积的色谱级乙酸乙酯萃取3 次，合并有机相，旋转蒸发至干燥；残留物用5 mL 色谱级甲醇溶解，即得到粗毒素样品。

采用HPLC 方法测定镰刀菌酸毒素的含量。流动相V(乙腈)∶V(0.4% H3PO4) = 30∶70，柱温40℃，流速1 mL/min，紫外检测器波长280 nm，进样量10 μL，出峰时间约为5 min。所有样品进样前均通过0.45 μm 的过滤器过滤除去杂质。镰刀菌酸标准品用色谱级甲醇溶解，并分别稀释配制成500、200、100、50、25 及12.5 μg/mL 质量浓度梯度，样品出峰时间与标准品对应。以得到的毒素吸收峰面积作为响应值，通过对比标准品的峰面积，计算得到样品中镰刀菌酸毒素的含量[14]。

1.2.4 菌丝形态观察 将西瓜枯萎病菌菌饼分别转接至含有EC50浓度桧木醇 (处理组) 和不含桧木醇 (空白对照组) 的PDA 培养皿中，于25 ℃下培养5 d。于上述菌落边缘切下10 mm × 10 mm 的菌丝块，置于2.5% 戊二醛溶液中固定过夜。然后用PBS 缓冲液漂洗，再经过梯度浓度的乙醇脱水、CO2临界点干燥、乙酸异戊酯和喷金处理后，在扫描电子显微镜下观察各组的菌丝形态，并拍照记录。

2 结果与分析

2.1 桧木醇对西瓜枯萎病菌的抑制活性

菌丝生长速率法测定结果 (表1 和图1) 表明：在桧木醇质量浓度为6.25～100 μg/mL 时，西瓜枯萎病菌菌丝生长均受到抑制，且随药剂质量浓度增加，抑制效果增强，100 μg/mL 时抑制率达到89.9%。其EC50值为31.1 μg/mL。

图1 桧木醇对西瓜枯萎病菌菌丝生长的影响Fig.1 The effect of hinokitiol on mycelial growth of F. oxysporum f.sp.niveum

表1 桧木醇对西瓜枯萎病菌的抑制作用Table 1 The virulence of hinokitiol to Fusarium oxysporum f.sp.niveum

孢子萌发法测定结果 (表1 和图2) 表明：在桧木醇质量浓度为6.25～100 μg/mL 时，西瓜枯萎病菌的孢子萌发均受到抑制，相应EC50值为45.2 μg/mL。

图2 桧木醇对西瓜枯萎病菌孢子萌发的影响Fig.2 The effect of hinokitiol on spore germination of F. oxysporum f.sp.niveum

2.2 桧木醇对西瓜枯萎病的盆栽防治效果

结果 (表2) 表明：500 和1000 μg/mL 两个测试质量浓度下，桧木醇对西瓜枯萎病均有显著的防治效果。其中，当桧木醇质量浓度为1000 μg/mL时，防效与多菌灵500 μg/mL 处理无显著差异。

表2 桧木醇对西瓜枯萎病的盆栽防效Table 2 The control efficacy of hinokitiol to watermelon fusarium wilt in pots

2.3 桧木醇对西瓜枯萎病菌生理生化指标的影响

2.3.1 对细胞膜通透性的影响 测定结果 (图3A)

图3 桧木醇对西瓜枯萎病菌电导率及镰刀菌酸含量的影响Fig.3 The relative conductivity and fusaric acid content in F. oxysporum f.sp.niveum treated with hinokitiol

表明：随时间延长，对照组和处理组菌丝的相对电导率均逐渐升高，且桧木醇处理组相对电导率均高于对照组，表明桧木醇可以破坏病原菌细胞膜的完整性，增大其细胞膜的通透性。

2.3.2 对镰刀菌酸含量的影响 测定结果 (图3B)显示：不同浓度桧木醇处理组西瓜枯萎病菌菌丝中镰刀菌酸含量均显著低于对照组，且具有剂量效应，即随着药剂质量浓度增加，镰刀菌酸含量显著降低。说明桧木醇可影响镰刀菌酸的代谢过程，明显抑制了西瓜枯萎病菌镰刀菌酸的生物合成或促进了其降解。

2.4 桧木醇对西瓜枯萎病菌菌丝形态的影响

通过扫描电镜观察发现，桧木醇对西瓜枯萎病菌菌丝形态有明显影响：对照组菌丝呈舒展、分散、较为均匀的生长状态 (图4A、4B、4C)，而桧木醇处理后菌丝呈现变形、扭曲、缠绕、成团生长等不规则形态 (图4D、4E、4F)。

3 讨论与结论

枯萎病是限制西瓜产业健康发展的主要瓶颈，该病害不仅造成西瓜严重减产，更重要的是会导致西瓜品质下降[2,15-17]。由于缺乏较好的抗病品种，目前对西瓜枯萎病的田间防治仍主要以施用化学药剂为主，但因其病原体可在土壤中长期生存、积累且进化迅速，化学药剂防控效果通常并不理想，使得对该病的有效防治变得十分困难[18-20]。

Amini 等[21]报道，咪鲜胺 (prochloraz)、糠菌唑 (bromuconazole)、苯菌灵 (benomyl) 和多菌灵(carbendazim) 能显著抑制尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum菌丝生长；Chung 等[22]发现，由于耐药性的差异，不同的尖孢镰刀菌分离株对苯菌灵、甲基硫菌素 (thiophanate-methyl)、多菌灵和噻菌灵(thiabendazole) 的敏感性各不相同；Reid 等[23]在温室中评估了苯菌灵、咯菌腈 (fludioxonil) 和噻菌灵对西瓜枯萎病的盆栽防效，发现与对照相比，3 种杀菌剂都降低了植株的死亡率。近年来随着绿色健康农业的快速发展，生物农药特别是植物源农药受到社会广泛关注。桧木醇具有超强的渗透力和吸附性，施入土壤后，可迅速渗透聚集到作物根部形成保护膜，因而在土传病害防治方面表现突出。多年的田间试验表明，桧木醇对由土传病原菌引起的立枯、青枯、根腐及软腐等病害的防治效果均较突出，被称为“植物癌症克星”[9,24-26]。

由于桧木醇突出的抗菌、抗病毒和抗肿瘤活性，其作用机制也受到广泛关注。现有研究表明，桧木醇可通过诱导特定基因发生时间特异性差异表达 (如P53基因的上调，BMI1基因和M D R 1基因的下调)、腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK) 途径或诱导活性氧 (ROS) 的产生而激活细胞内在的凋亡通路[27-29]或细胞自噬通路[30-32]；通过抑制蛋白酶的活性或增强细胞内过氧化氢酶(CAT) 和超氧化物歧化酶 (SOD) 的活性，最终诱导细胞死亡[33-35]；通过调节表观修饰，如DNA 甲基化以及组蛋白去乙酰化等而诱导细胞凋亡[36-38]；还可以调控与生物膜发育相关的特定基因的表达水平，抑制细胞膜的代谢，调控细胞膜的通透性，抑制呼吸作用等而促使细胞死亡[39-41]；此外，桧木醇还可通过其羟基酮部分结合细胞内的Fe3+，抑制线粒体呼吸链复合物I 和II 的活性[42]，推测桧木醇可能诱发了一种新的死亡机制——铁死亡[43-45]。因此，桧木醇可能存在多种诱导细胞死亡的途径。

本研究通过离体及活体试验，测定了植物源天然产物桧木醇对西瓜枯萎病菌的抑制活性及对西瓜枯萎病的盆栽防效。结果表明，桧木醇对西瓜枯萎病菌的抑制效果明显，其对病原菌菌丝生长和孢子萌发的EC50值分别为31.1 和45.2 μg/mL；在1000 μg/mL 时，桧木醇对西瓜枯萎病菌的防效为75.2%，与对照药剂多菌灵500 μg/mL 的防效相当。表明桧木醇对西瓜枯萎病菌具有较强的抑制活性，可考虑作为潜在替代药剂用于防治西瓜枯萎病。

细胞膜的完整性对于细胞和菌丝的生长具有重要意义，其在维持细胞形态、传递信息和与外界进行物质交换等过程中均起到重要作用[46-48]。本研究表明，桧木醇可明显影响病原菌菌丝体的正常生长，破坏细胞膜的完整性，使得其通透性发生改变，细胞内电解质外渗，相对电导率升高，这与用桧木醇处理灰霉病菌和炭疽病菌[49]的研究结果一致。表明桧木醇对西瓜枯萎病菌的作用机制可能归因于其破坏细胞膜的能力，使细胞内容物渗漏，破坏渗透平衡，最终导致病原菌细胞死亡。镰刀菌酸是由西瓜枯萎病菌产生的一种毒力因子，在病原菌致病及症状发展过程中起到主导作用[50-52]。经桧木醇处理后，病原菌体内镰刀菌酸含量显著下降，表明桧木醇能够显著抑制镰刀菌酸的生物合成或促进其降解，改变镰刀菌酸的代谢过程以降低病原菌的致病力。

综上所述，桧木醇不仅能显著抑制西瓜枯萎病菌菌丝的生长及孢子萌发，更重要的是能够明显抑制其致病因子镰刀菌酸的产生，具有抑菌与“降毒”双重功效。桧木醇的主要作用机制可能是通过破坏病原菌细胞膜的完整性、干扰病原菌次生代谢物的合成而最终发挥抑菌作用，但其具体的抑菌分子靶标仍值得深入研究。本研究表明，桧木醇作为植物源天然产物，具有开发为植物源杀菌剂用于防治西瓜枯萎病的巨大潜力。