重离子束辐照阿维菌素菌种选育与发酵工艺优化

李荣祎

（核工业甘肃矿冶局，甘肃兰州 730030）

0.引言

阿维菌素是一种生物农药，符合世界农药发展趋势和我国产业政策。被广泛用于动植物病害防治，是主要的生物农药和兽药品种之一，作为推荐使用的高效低毒的农药产品，具有较好的市场前景。菌种选育常用的方法包括化学诱变、r-射线辐照诱变、基因重组等，重离子束辐照诱变具有周期短、稳定性好等优点，诱变选育阿维菌素菌种，不仅可以提高阿维菌素的产能，还使有效组分AVMB1a 组分比例显著提高。

1.菌种选育

利用中国科学院近代物理研究所中重离子束辐照诱变的高产菌株。首先在实验室对小 试基本条件进行验证，分别从温度、湿度、摇床转速、振幅、摇瓶容积、装液量等方面进行试验，确保实验室条件满足小试需求，再对重离子束诱变获得的菌株进一步分离纯化及筛选，获得性能相对稳定的高产菌株[1]。

1.1 分离纯化

将出发菌种铲取0.2cm2～0.5cm2大小菌苔制备单孢子菌悬液备用。用十倍稀释法一次做10-2、10-3、10-4、10-5梯度。用吸管吸取稀释液，滴加1 滴（约0.3ml ～0.5ml）于各个平板中，涂布10-3、10-4、10-5梯度。27.5℃±0.5℃恒温培养6d ～7d 后保存备用。

1.2 初筛

挑选草帽型（如图1 所示为菌落形态）、灰白色、饱满、较圆、直径0.25mm 以上形态较好的单菌落均匀涂于斜面。27.5 ℃±0.5 ℃，湿度30%～40%，6d ～7d后斜面具有如下特征：斜面表面全部长满均匀一致、灰白色孢子，斜面背面有微黄色色素扩散至琼脂中。培养成熟的斜面保存备用。

图1 菌落形态

种子摇瓶培养：250ml 三角瓶，装量40ml。铲取F1代斜面0.5cm2～1cm2左右到种子摇瓶中，每支斜面接一支摇瓶。恒温27.8℃～28.2℃，转速260 转/min，振幅2.5cm，培养28h 后摘下备用。

发酵瓶培养：为250ml 三角瓶，装量为40ml。取一级种1.6ml（接种量为4%）至发酵瓶中，恒温27.8℃～28.2℃，转速250 转/分，振幅3.0cm。发酵瓶培养256h 后测效价。

通过发酵过程中菌丝形态（如图2 所示为菌丝形态）观察，发酵效价检测，筛选性能稳定的优良菌种。

图2 斜面菌种、菌丝形态

1.3 复筛（方法同初筛）

F2 代斜面制备：将选出的初筛F1 代斜面涂抹于空白斜面上，每支F1 代斜面传3 支F2 代斜面。

1.4 结果分析

研究表明，草帽型菌落的产抗能力均高于其他菌落。故以挑选草帽型菌落为最佳[1-2]。

对经诱变处理、分离筛选获得的高产菌株进行产能及效价测定，与出发菌株对照，结果显示：选育菌株性能明显优于对照菌株，效价可达6000μg/ml 以上，主要活性成分AVMB1a 在产物中的所占比例明显提高，以此作为试验菌株传代培养，阿维菌素产能及有效组分基本稳定。

2.发酵培养基及工艺条件优化试验

根据菌种特性及生长营养要求，利用单因子试验法、均匀设计原理，分析不同碳源、氮源及其配比对阿维菌素发酵单位的影响，以获得适宜的种子培养基和发酵培养基配方，初步得出中试基本工艺控制参数，为放大中试及生产进一步优化工艺提供依据[2-3]。

2.1 种量及种龄关系研究

250ml 摇瓶装量40ml，转速250r/min，振幅2.5cm～3.0cm，接种量分别按3%、4%、5%、6% 4 个梯度做对照试验，种龄按26h、28h、32h、36h 梯度做对比试验，结果如表1 所示。

表1 种龄及种量试验

种量及种龄试验分析：采用较大的接种量有利于提前形成产物，可以有效缩短发酵周期。但是，如果接种量过大，菌丝往往生长过快，造成发酵液黏度增加、溶解氧不足，影响微生物正常代谢和产物的积累。而接种量过小，使得发酵周期延长。经试验，发酵摇瓶接种量以4%～5%为最佳[2-3]，相应发酵罐接种量8%～10%为好。

种子种龄过短则接入发酵后生长过慢，菌种生长期延长，在生长期内营养物质消耗过快，导致产抗营养不足，最终效价偏低；过长则接入发酵后，菌丝生长过快，容易使料液变黏稠，中后期营养物质利用慢，最终效价低。故将种龄控制在28h ～32h 为最佳。

2.2 主要碳源、氮源、无机盐及微量元素试验

2.2.1 主要碳源对发酵影响分析

选择不同的碳源类物质组成不同的培养基配方（总碳量保持一致），其他组成不变反复进行试验发酵，与对照组比对，结果如表2 所示。

表2 不同碳源摇瓶发酵效价对比

碳源试验结果分析：麦芽糊精作为主要碳源时发酵效价比对照组高5%～10%，而且高浓度有利于提高发酵产量。淀粉加葡萄糖作为碳源时，由于还原性糖浓度过高，发酵前期菌丝不结成菌球，料液黏度过大，导致氧的传递受阻，中后期发酵效价仍极低，只能提前放罐。淀粉液化液作为发酵的唯一碳源时，仍有大量分散菌丝，发酵效价受到一定影响。

综合考虑原料的易得性、原料价格及对发酵产能的影响，选择麦芽糊精作为发酵培养基碳源较佳。

2.2.2 主要氮源物质及微量元素对发酵的影响

各种浓度的有机氮源类物质互相搭配，组成不同的有机氮源配方进行对照试验。测试了4 种有机氮源在同一水平上、不同配比形式对于阿维菌素产量的影响。按照不同比例配比一定量的无机氮源，分别进行对比试验，结果如表3 所示。

表3 氮源及无机盐均匀设计试验

氮源物质及微量元素对发酵的试验结果分析：结果显示，热榨黄豆饼粉、花生饼粉、酵母粉作为复合氮源时，其发酵单位比其他配方高10%～15%。几种无机氮源在一定浓度范围内，阿维菌素的产能均有一定的提升，其中以一定量的(NH4)2SO4作用最为明显，可以使产量提高10%；硝酸铵作为无机氮源时对于发酵效果无明显影响。

2.3 发酵工艺优化试验研究

利用FUS-50L 发酵罐做控制工艺优化试验，接种种子摇瓶，培养24h 左右，观察菌丝为网状分布时接入发酵罐，发酵罐投料30L，接种量为8%～10%。通过多批次试验，对发酵过程温度、碳氮比、转速、通气比等进行优化，确定最佳工艺控制参数[3-4]。

2.3.1 不同温度条件下发酵效果对比

由于阿维菌素对温度较为敏感，温度过高或过低均会影响菌种正常产抗生素水平，故在发酵过程控制中必须确定最佳发酵温度范围。

表4 不同温度发酵效价对比

发酵温度的试验结果分析：温度在（28±0.5）℃时发酵效价最高，温度在27℃以下时生长缓慢，效价相对较低，温度在29℃以上时菌种生长较快，但发酵效价不高。

2.3.2 pH 值

经试验发酵液的pH 调至6 ～7 为最佳，pH 过高或过低都会对发酵产能造成不利影响[4-5]。

为了使pH 满足微生物生长及代谢产物积累，在培养基内加入(NH4)2SO4是一种有效方法。因(NH4)2SO4在培养液中可分解为NH4+和SO42-，NH4+可以供微生物利用，而SO42-又能使培养基pH 值相对保持稳定。

3.中试发酵生产

在1000L 发酵罐上进行多批次发酵试验，对发酵配方、工艺参数持续优化的基础上，用高产菌株在5000L 发酵罐上进行了放大试验，连续生产3 批发酵液B1a 组份的含量分别为4664μg/ml、4664μg/ml 和4892μg/ml。先后完成中试连续生产10 个批次，平均发酵周期260h，放料体积4.0t，平均效价4600mg/L。

4.研究成果及应用前景

本项目研究了利用重离子辐照诱变阿维链霉菌菌株，通过大量筛选获得了高产菌株，摇瓶发酵试验结果显示，获取的正突变菌株产抗生素能力比出发菌株有一定程度的提高。对筛选出的高产菌株再进行反复考察和对发酵培养基进行优化，选择出生产性能优良且稳定的高产菌株，使其摇瓶发酵效价达到了6000μg/ml，5m3发酵罐生产发酵效价有效组分B1a 含量可达到4600mg/L 以上。

该项目研究已经通过了甘肃省科技厅组织的成果鉴定鉴定委员会一致认为：该项目研究目标明确，技术路线先进，数据可靠，采用重离子束辐照诱变选育阿维菌素菌种具有先进性，所获得的4600 以上发酵效价及相关工艺技术属国内领先水平，同意通过科技成果鉴定。

重离子辐照诱变阿维链霉菌种为工业微生物生产菌种选育提供了参考依据。研究成果对提高阿维菌素发酵水平、节约资源具有重要参考价值、潜在的社会和经济效益可观，有较好的推广前景。