小鼠成骨细胞对高加速度力学微环境的弹性响应＊

杨文凯 王 鑫

（1.天津理工大学天津市先进机电系统设计与智能控制重点实验室，天津 300384；2.机电工程国家级实验教学示范中心（天津理工大学），天津 300384）

0.引言

在载人航天器的发射与返回、现代高性能战斗机的起飞与降落等国家重大军事行动和科研探索的过程中，航天员和飞行员经常会暴露于高加速度的极端力学环境中[1]，所承受的重力加速度往往超出正常环境的几倍[2]，而当碰到一些特殊情况如飞船应急逃逸、紧急返航或是宇航员训练过程时，所承受的重力加速度则会达到近10 倍[3]。

骨骼作为维持人体生命的重要器官之一，是身体对机械负荷的主要承担结构，是构成机体运动系统的核心部分[4]。在正常的骨组织中，三类细胞即成骨细胞、破骨细胞以及骨细胞各司其职、各谋其政，在特定的力学微环境中，维持着骨组织的重建与吸收的动态平衡。人体组织均具有一定的力学微环境适应性，对于骨组织来说，成骨细胞能够感受外在力学载荷，并对其做出相应的力学响应，主要负责骨组织的重建[5]。成骨细胞主要负责骨基质的合成、分泌和矿化，是骨形成的主要功能细胞[6]。力学环境对控制和影响骨重建与骨吸收起到了至关重要的作用[7]。力学环境是控制和影响骨重建的重要因素。在生理状态下，骨处于最佳力学环境中，骨吸收和骨形成之间是一种动态平衡。当骨的力学环境变化时，动态平衡随之改变，骨的组织、细胞也发生相应的变化，通过骨吸收和骨形成，最终在新的基础上达到新的平衡。成骨细胞和破骨细胞的动态平衡维持了体内的骨量，机械应力刺激则是其平衡的重要调节因素，在骨重塑和吸收过程中发挥着至关重要的作用。

本文采用小鼠成骨细胞（MC3T3-E1）作为细胞模型。细胞按加速度力学加载分为1G、5G、10G、20G、40G 和100G 组，以不加载细胞为对照组。利用之前研发的力学加载装置对细胞进行加载，采用频率为连续3d，每天30min，从而模拟高加速度力学微环境，进而研究力学因素在骨组织重建过程中所起到的关键性作用。利用原子力显微镜对细胞进行纳米压痕实验，使用经典赫兹接触力学模型拟合细胞加载曲线，进行细胞的弹性模量，得出细胞的弹性性质。结果表明，在5G 加速度力学微环境下，细胞的弹性响应有所增强，对应于细胞核和细胞质区域的细胞骨架重排。本文的研究结果为组织工程中研究高重力力学微环境下骨组织的力学生物学响应提供了可靠的理论依据。

1.材料和方法

1.1 小鼠MC3T3-E1 的培养方法

细胞培养液为含有10%胎牛血清（Gibco，USA）的-MEN培养液（Gibco，USA），使用0.25%胰蛋白酶（Trypsin，Gibco，USA）消化细胞，在消化细胞之前用磷酸盐缓冲液（PBS，Solarbio，CHINA）冲洗细胞。

1.2 细胞实验分组及加载方法

细胞按加速度力学加载分为1G、5G、10G、20G、40G 和100G 组，以不加载细胞为对照组。利用之前研发的力学加载装置对细胞进行加载，采用频率为连续3d，每天30min，从而模拟高加速度力学微环境，进而研究力学因素在骨组织重建过程中所起到的关键性作用。

课题组设计了一款细胞离心式加载机，该细胞离心式加载机可以利用实验室现有的培养条件和常用的培养细胞容器，对细胞进行离心高加速度加载。加载机内部转子采用了凹槽设计，使25cm2的细胞培养瓶和直径小于60mm 的培养皿都可固定于转子体两侧凹槽内。为探究高加速度力学环境对成骨细胞的生化影响，我们使用离心式加载机模拟细胞处于高加速度力学环境中。首先将细胞分为对照组、1G 组、5G 组、10G 组、20G 组、40G 组和100G 组，计算出各组对应的转速。在实验过程中对照组除加载实验外与实验组做相同处理。使用预先研发的实验设备进行加载，连续3d，每天30min，模拟成骨细胞处于高加速度力学微环境中，对照组同步置于除加载外相同的培养环境中，研究力学因素在骨组织重建过程中的作用。

1.3 AFM 弹性属性表征

本实验室所使用的原子力显微镜是BioScope Resolve AFM（Atomic Force Microscopy，Bruker）。对MC3T3-E1进行形貌高分辨表征以及力学属性表征时，细胞均置于细胞培养液中，且使用加热台保持液体温度维持在37℃左右。AFM 所使用的探针为PFQNM-LC-A-CAL（Bruker），弹性系数k=0.1N/m，探针尖端为球形，R=65nm。实验的工作模式为PeakForce QNM in Fluid，对细胞进行高分辨扫描，从而得出细胞的形貌图，进而区分细胞核与细胞质区域，然而，转换为Force Volume 模式，对每个区域做3 ～5 组力曲线，每组32×32 条，最后采用经典赫兹接触力学模型拟合细胞加载曲线，进行得出细胞的弹性模量，得出细胞的弹性性质出模量图。

1.4 结果

根据Hertzian 理论公式：

可知在外载荷作用下，细胞的力学响应与探针的半径、刚体压入细胞的深度、细胞泊松比和弹性模量有关。F为探针对细胞的作用力，E为单个MC3T3-E1 的弹性模量，R为探针的针尖半径（～65nm），δ为探针的压入深度，ν为MC3T3-E1 的泊松比（等于0.5）。

图1 为MC3T3-E1 的弹性模量值结果，MC3T3-E1在受到高加速度加载后，细胞核区与细胞质区的弹性模量属性均会发生变化，且变化趋势不尽相同。在细胞核区，低加速度作用（1G、5G、10G），MC3T3-E1 的弹性模量与对照组相比变化不大（2 ～2.3kPa），但是当加速度加载达到20G 及其以上时，核区的弹性模量值有所下降（小于2kPa），当加速度加载达到100G 时，核区的弹性模量=0.85kPa。高加速度加载对细胞质区的影响则更为显著。基于AFM 实验结果，MC3T3-E1 在1G 的加速度加载后，质区的弹性模量开始增大，当高加速度=5G 时，质区弹性模量 = 6.55kPa；而当高加速度加载超过10G后，质区弹性模量开始降低，甚至低于对照组，当高加速度加载=100G 时，质区的弹性模量=2.28kPa。细胞核区域的弹性力学属性较细胞质区域软。

图1 高加速度加载后细胞核以及细胞质区域弹性模量结果

2.结论

生物力学问题与人类生命健康密切相关，已经成为近年来力学、物理学、生命科学和医学等学科所关注的交叉学科热点问题。原子力显微镜是近年来在纳米探测领域崛起的新型探测工具，它逐渐克服了对生命体组织和细胞等样品的探测难题，凭借其简便高效的检测方法迅速成为纳米生物科学中使用最广泛的仪器设备，受到了许多研究者的青睐。对于高加速度力学环境下生物组织如何响应，成骨细胞如何变化的研究一直停留在对于这些组织和细胞的生化响应方面。本研究利用新型仪器原子力显微镜测量了经过高重力加速度加载后，成骨细胞表面弹性模量的变化，从成骨细胞对于高加速度力学微环境的力学响应做出了研究。

在骨所处的力学环境中，成骨细胞不但是骨形成过程中的主要功能细胞，也是骨感受外界刺激和力学载荷的主要细胞，成骨细胞对外界力学刺激的响应很敏感。本课题采用跨尺度方法对高加速度力学加载条件下成骨细胞所产生的力学生物学影响进行了较为深入的研究，采用AFM表征了高加速度加载后细胞的形貌以及力学属性，这与本课题前期采用MTT 实验表征细胞增殖能力，Western blot 实验检测力学加载条件下成骨细胞沿骨向分化目标蛋白的表达，共聚焦荧光显微镜显示细胞骨架以及铺展面积的变化等结果均妥合。从实验结果中来看，重力加速度对细胞表面的硬度有明显的影响，但是对细胞核区域和细胞质区域的影响又略有不同。在低重力加速度（1G、5G、10G）加载后，相比于对照组来说，细胞核区域的杨氏模量并未发生明显变化，但是细胞质区域杨氏模量有明显的增大；在高重力加速度（20G、40G、100G）加载后，细胞核区域和细胞质区域的杨氏模量均下降，且加速度值越大，杨氏模量下降越大。可以得出，适当的力学会提高成骨细胞MC3T3-E1 的力学响应，然后过度加载会降低成骨细胞的力学适应性，甚至导致影响细胞的功能性，导致细胞凋亡。