dss1突变体叶色突变机制研究

黄仁权

(贵州农业职业学院, 贵阳 551400)

叶绿素是绿色植物叶绿体内参与光合作用的重要色素,在光合作用的能量捕获及能量传递中起着重要作用。叶绿素合成是一个复杂的过程,需要20多个基因编码的16种酶共同参与完成[1],该途径中任何一个环节发生突变都可能影响叶绿素的合成,从而引起叶色异常甚至导致植株死亡。因此,对作物叶色突变体的研究,探讨叶绿素的生物合成途径具有重要意义。

水稻是一种重要的粮食作物,水稻生产对全球粮食安全以及可持续发展具有极其重要的地位[2]。黎平杂边禾dss1突变体是贵州大学农业生物工程重点实验室课题组通过EMS诱变获得稳定遗传的水稻突变体,该突变体叶片从分蘖期开始表现叶色深绿,整个生长期都保持这一特性,是一份极具研究潜力的叶色突变体材料。为了探究黎平杂边禾dss1突变体叶色深绿的突变机制,进一步丰富叶色育种突变体库材料,本研究对dss1突变体叶绿素含量及叶绿素合成途径中的前体物质进行测定,同时对叶绿素合成途径中的关键基因表达量进行分析,以期为水稻叶色突变体育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

黎平杂边禾dss1突变体由贵州大学农业生物工程重点实验室提供。

1.2 方 法

1.2.1叶绿素含量测定

于水稻分蘖期采摘剑叶,测定时每份材料随机选取长势相对一致的植株各10株,叶绿素含量测定参照沈伟其[3]方法进行。利用BECKMAN DU 640型分光光度计测定浸提液在470 nm、645 nm和663 nm波长处的吸光值,3次重复。

1.2.2叶绿素前体物质测定

选取籽粒饱满的dss1突变体和野生型种子,利用1% NaClO溶液分别对其种子表面漂洗10 min,用清水冲洗20 min后盛入网袋,放置于37 ℃恒温箱培养,待其露白后播种于培养皿中,并以滤纸作为固定基质,在黑暗条件下培养10 d后取子叶测定叶绿素前体物质。其中,δ-氨基乙酰丙酸(ALA)参考Dei[4]方法测定,胆色素原(PBG)参考Bogorad[5]方法测定,尿卟啉原Ⅲ(Urogen Ⅲ)和粪卟啉原(Coprogen Ⅲ)参照Bogorad[5]方法测定,原卟啉Ⅸ(Proto Ⅸ)、镁原卟啉(Mg-Proto)和原脱植基叶绿素(Pchlide)参考Rebeiz等[6]和Lee等[7]的方法测定。

1.2.3引物设计

根据GenBank中已报道基因序列,运用BIAST程序对叶绿素合成途径中关键基因引物进行设计(表1)。

表1 叶绿素合成相关基因Real-time PCR检测引物

1.2.4Real-time PCR反应

Real-time PCR反应根据ABI Power SYBR®Green PCR Master Mix使用操作说明进行,冰上配置反应液,ABI公司7500 Real time PCR仪上进行反应,PCR反应体系为:Power SYBR®Green PCR Master Mix 10 μL, Forward Primer 1 μL, Reverse Primer 1 μL, Template cDNA 1 μL, 水7 μL,反应条件为95 ℃ 10 min 1 cycle;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min 40 cycles。

1.3 数据分析

实验所得数据通过Excel软件和SPSS软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 dss1突变体叶绿素含量

与野生型水稻相比,dss1突变体从分蘖期开始表现出植株矮小、叶色深绿的特征。分蘖期dss1突变体类胡萝卜素含量与野生型含量差异不显著,但叶绿素a和叶绿素b含量分别为野生型的1.4倍和1.3倍,光合色素含量比野生型增加25.6%,差异达极显著水平(图1 A;图1 B)。说明dss1突变体叶色深绿是由于光合色素含量增加导致的。

图1 dss1与野生型表型

2.2 dss1突变体叶绿素合成前体物质含量

从图2 C～图2 E可以看出,在叶绿素合成途径中,从δ-氨基乙酰丙酸(ALA)到原卟啉Ⅸ(Proto Ⅸ)含量都是dss1突变体低于野生型。随着叶绿素合成代谢的进行,后期合成的Mg-Proto和Pchlide含量dss1突变体却显著高于野生型,dss1突变体中原卟啉(Proto Ⅸ)含量为野生型的47.5%,而镁原卟啉(Mg-Proto)含量为野生型的1.71倍。

2.3 dss1突变体叶绿素合成途径关键基因表达差异

利用Real-time PCR检测分蘖期dss1突变体和野生型水稻中叶绿素合成途径中关键基因的表达水平。由图3 F可知,dss1突变体中CHLD基因的表达水平比野生型低,而CHLH基因和DVR基因的表达量比野生型高,分别为野生型的4.1倍和1.6倍,CAO基因的表达量与野生型差异不显著。罗韬[8]研究表明,CHLH亚基在反应过程中主要是进行底物运输,CHLH基因的表达水平是镁离子鳌合酶活性调控的关键点。由此可以说明,dss1突变体中Mg-Proto Ⅸ的合成较野生型高,是由于CHLH基因高表达调控的结果。

3 结论与讨论

叶绿素是绿色植物叶绿体内参与光合作用的重要色素,其合成途径中相关物质含量发生变化,将会影响植株正常生长。关于叶绿素缺乏而导致的叶色突变体报道较多,如OsCAO1基因的突变会导致植株叶绿素b合成严重受阻和含量减少,并表现出苍白叶表型,其植株不能正常进行光合作用,甚至早衰早亡[9];YGL1编码叶绿素合酶,催化叶绿素酸醋a转化为叶绿素a,该基因的突变导致突变体ygl1叶绿素合成受阻,表现为黄绿叶[10]。而在植株生长周期中叶色加深或保持绿色等相关的水稻突变体却鲜有报道。本研究发现,dss1突变体从分蘖期开始表现出叶色较野生型深绿,并且在后期的生长中叶色一直保持深绿的特征,这对维持植株后期较高的光合作用从而促进籽粒的积累具有重要作用。因此,dss1突变体可作为良好的科研材料,对丰富水稻叶色突变体库以及品质改良等方面具有重要的研究价值。

本研究通过前体物质测定发现,dss1突变体与野生型主要是在由镁离子鳌合酶调控从Proto Ⅸ合成Mg-Proto这一步骤存在差异,其中编码该酶的CHLH基因在dss1突变体中显著上调于野生型,推测可能是由于在dss1突变体中控制该突变性状基因发生突变,影响CHLH基因的表达从而影响镁离子鳌合酶活性,最终影响植株叶绿素的合成。