不同浓度褪黑素处理对采后猕猴桃抗灰霉病的影响

段春杨，田登娟，黄二宾，王芳，2，邓佳，3

(1. 西南林业大学林学院，云南昆明 650224；2. 西南林业大学西南地区生物多样性保育国家林业和草原局重点实验室，云南昆明 650224；3. 西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室，云南昆明 650224)

猕猴桃是猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(ActinidiaLindl.)多年生草本植物，素有“水果之王”的美誉[1]。 猕猴桃具有重要的经济价值，但由于多种因素易发生腐烂、病害等，从而失去食用价值[2]，给猕猴桃产业发展造成损失。 据报道，常见猕猴桃病害以真菌类病原菌为主，而其中又以青霉病、灰霉病和软腐病最为普遍[3-6]。 因此，加强猕猴桃采后保鲜相关研究具有十分重要的研究价值、经济价值和社会价值。 采后果实病害的控制方法分为物理、化学、生物方法，目前以化学方法为主。 但随着生活水平的提高，人们对于健康和环保问题越来越重视，迫使人们探究更加安全、健康、有效的化学防治替代品。 与化学方法相比，生物方法强调抑菌物质为自然界存在的、可天然提取、非人工合成的天然有机物质，因其具有更高的生物安全性、环境友好性而成为研究的热点方向[7]。 褪黑素、钙、碳酸氢钠、抗坏血酸、水杨酸、植酸、壳聚糖、海藻糖等能够抑制水果上病原菌的生长，从而达到降低水果病害发生率的目的，具有很好的应用前景。 所以，寻找化学杀菌剂的替代物来防治果蔬病害，是今后果蔬产品贮藏保鲜工作的重点之一[8，9]。

褪黑素(melatonin，MT)是一种吲哚类小分子物质，于1995 年首次在植物中被鉴定出来，此后发现褪黑素存在于多种植物和植物产品中[10-12]。褪黑素在调控植物发芽、分化、开花、昼夜节律、光合作用以及成熟和衰老中具有重要作用。 近年来，褪黑素在控制采后病害中的作用已受到广泛关注。 研究表明，外源施用0.1 mmol/L 褪黑素能抑制樱桃和番茄果实因感染灰葡萄孢菌引起的灰霉病，并增加相关防御酶和代谢产物水平，提高内源性褪黑素和水杨酸含量，从而提高果实抗病性[13]。 此外，褪黑素在苹果、梨、大枣等种植中得到大量应用，能够提高果实的贮藏品质。 然而有关褪黑素对采后猕猴桃果实灰霉病生物防治的研究却少有报道。 因此，本试验以猕猴桃为材料，研究不同浓度褪黑素对猕猴桃灰霉病的防控效果，筛选出最佳浓度；在此基础上从生理生化方面研究褪黑素对灰霉菌细胞膜的破坏效果，既为猕猴桃果实灰霉病的生物防治积累资源，也为褪黑素的应用拓展途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验品种为四川浦江红心猕猴桃，购于昆明市金马正昌水果批发市场。

褪黑素购于上海西格玛奥德里奇贸易有限公司。

灰霉菌(Botrytis cinerea)分离自猕猴桃病果表面，置于PDA 培养基上28℃培养，备用。

1.2 试验方法

1.2.1 褪黑素体外抑菌试验 (1)对病原菌菌丝的抑制作用:采用十字交叉法，在PDA 培养基中心接种6 mm 灰霉菌菌饼，在其四周距离3 cm 左右处放置4 片滤纸，滤纸分别滴入20 μL 同一处理浓度的褪黑素，褪黑素浓度设为0.05、0.10、0.20 mmol/L，接种好的培养基密封，放入恒温箱(25℃)培养2 d 后观察抑菌效果，记录灰霉菌病斑直径。 用无菌水取代褪黑素作为空白对照[14，15]，每处理重复3 次。

(2)孢子萌发率及芽孢管长测定:参考Qin等[16]的方法略改动。 取不同浓度(0.05、0.10、0.20 mmol/L)的褪黑素和无菌水各1 mL，加至装有50 mL PDB 培养基的锥形瓶(容积为100 mL)中，之后加入1 mL 灰霉菌孢子悬浮液(106cfu/mL，下同)，28℃、120 r/min 培养12 h。 每个处理重复3 次。 孢子萌发率、芽孢管长测定方法参见孔珊珊等[8]的方法。

1.2.2 褪黑素体内抑菌试验 将猕猴桃果实用浓度为2%的次氯酸钠浸泡2 min 后，用蒸馏水冲洗干净，置于室温条件下通风晾干。 将消毒好的猕猴桃果实放在无菌操作台内，用已灭菌的打孔器在果实赤道部位等距离的刺2 个孔(深4 mm、直径4 mm)，待孔内汁液自然晾干后，用移液枪分别向每个孔洞中注入10 μL 灰霉菌孢子悬浮液和10 μL 不同浓度(0.05、0.10、0.20 mmol/L)的褪黑素，待液体全部吸收后，用自封袋进行单果包装，置于塑料筐内室温贮藏。 用无菌水取代褪黑素作为空白对照，每个处理5 个果实。

发病率(%)＝果实发病总孔数/果实接种总孔数×100 。

1.2.3 褪黑素对灰霉菌的溶菌作用 相对电导率的测定参考Elsherbiny 等[17]的方法并做适当调整。 将6 mm 灰霉菌丝块转移至含有10 mL PDB培养基的20 mL 离心管中，25℃摇床上120 r/min培养72 h，无菌水清洗菌丝(清除PDB 培养基)并将其转移至含有4 mL 不同浓度褪黑素的10 mL离心管中，以无菌水处理作为对照，每个处理重复3 次，28℃摇床上120 r/min 培养，分别于4、8、12、24、48、72 h 取样，并测定电导率R1，后于沸水中加热30 min，冷却到室温后测定电导率R2，计算相对电导率(R1/R2×100%)。

将收集的6 个时间点的样品在4℃、5000 × g离心2 min。 获得的上清液用于胞外核酸渗透量和可溶性蛋白含量的测定，样品的组织部分用于测定丙二醛(MDA)含量。 胞外核酸渗透量以OD260值表示(用Thermo Scientific 赛默飞Nano-Drop 2000 红外分光光度计测量)，可溶性蛋白和MDA 含量的测定与计算方法参照苏州研犀生物科技有限公司相应试剂盒的说明书完成。

1.2.4 褪黑素对猕猴桃果实采后贮藏品质的影响 用清水冲洗果皮表面晾干，再用75%乙醇擦试果皮表面自然晾干，待用。 将60 个猕猴桃果实平均分为2 组。 第一处理用最佳浓度的褪黑素浸泡，第二处理用无菌水浸泡，浸泡时间3 min。 所有果实自然晾干进行单果包装，置于塑料盒内室温贮藏。

分别于处理后第0、2、4、6、8、10 天取果实赤道部位皮下3 ～8 mm 果肉组织，快速置于-80℃冰箱内保存。 参见曹建康等[18]的方法测定可溶性固型物(SSC)、可滴定酸(TA)、抗坏血酸(ASA)、还原糖含量。 每次测量5 个果实。

1.3 数据分析

使用Microsoft Excel 软件制图，采用SPSS Statistics 23.0 软件进行Duncan’s 多重差异显著性分析，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同浓度褪黑素对灰霉菌菌落生长的影响

从图1 可以看出，培养3 ～5 d，0.10、0.20 mmol/L 褪黑素处理的灰霉菌菌落直径均与CK存在显著差异；培养4 d 和5 d，0.10 mmol/L 褪黑素处理的灰霉菌菌落直径显著低于0.05 mmol/L和0.20 mmol/L 褪黑素处理。 所以，褪黑素处理对灰霉菌的生长有显著抑制作用，0.10 mmol/L褪黑素处理对灰霉的抑制效果优于0.05 mmol/L和0.20 mmol/L 褪黑素处理。

图1 不同浓度褪黑素处理下灰霉菌病斑直径

2.2 不同浓度褪黑素处理对灰霉菌孢子萌发的影响

从表1 可以得出，与CK 相比，不同浓度褪黑素处理显著抑制了灰霉菌的孢子萌发，0.05、0.10、0.20 mmol/L 褪黑素处理的孢子萌发率分别比CK 降低29.33、41.66、61.66 个百分点，其中，0.20 mmol/L 褪黑素处理孢子萌发率显著低于0.10 mmol/L 和0.05 mmol/L 褪黑素处理。 不同浓度褪黑素处理显著抑制了灰霉菌的芽孢管长，0.20 mmol/L 褪黑素处理抑制效果优于其它两个浓度。 所以，褪黑素处理对灰霉菌孢子萌发、孢子管生长均有显著抑制作用，在所取的褪黑素浓度处理范围内，抑制效果与褪黑素浓度处理呈正相关关系，0.20 mmol/L 褪黑素处理效果最佳。

表1 不同浓度褪黑素处理下灰霉菌孢子萌发情况

2.3 不同浓度褪黑素处理对贮藏期猕猴桃果实灰霉病发病率的影响

由表2 可知，与CK 相比，不同浓度褪黑素处理降低了贮藏期猕猴桃果实灰霉菌的发病率，至第10 天CK 的猕猴桃果实完全发病，0.05、0.10、0.20 mmol/L 褪黑素处理分别比CK 降低40、60、20个百分点。褪黑素处理能够降低贮藏期猕猴桃果实灰霉病的发病率，且以0.10 mmol/L 褪黑素处理效果最优。

表2 不同浓度褪黑素处理下贮藏期猕猴桃果实灰霉病发病率(%)

2.4 不同浓度褪黑素处理下灰霉菌细胞膜通透性的变化

通过检测灰霉菌菌丝的相对电导率来评估灰霉菌的细胞膜通透性。 从图2A 可以看出，不同浓度褪黑素处理和CK 的菌丝相对电导率随培养时间的延长总体呈上升趋势。 培养4 h，不同浓度褪黑素处理和CK 的菌丝相对电导率存在显著差异，且0.20 mmol/L 褪黑素处理显著高于其它两个处理；培养8～72 h，不同浓度褪黑素处理和CK的菌丝相对电导率存在显著差异，但不同浓度褪黑素处理间基本不存在显著差异。 因此，不同浓度褪黑素处理可显著提高灰霉菌菌丝的相对电导率。

图2 不同浓度褪黑素处理对灰霉菌细胞膜通透性的影响

病原菌菌丝体核酸渗透量被认为是细胞膜损伤的一项重要指标。 从图2B 可以看出，0.05、0.10、0.20 mmol/L 褪黑素处理和CK 的OD260值在48 h 内均呈上升趋势，并于培养48 h 达到最大值(1.4117、1.5187、2.4713 和1.1793)，之后下降。与CK 相比，褪黑素处理下的细胞外核酸含量显著升高，其中，0.20 mmol/L 褪黑素处理显著高于0.10 mmol/L 和0.05 mmol/L 褪黑素处理。 所以，褪黑素处理对灰霉菌细胞膜有显著破坏作用，在所选褪黑素浓度处理范围内，破坏效果与褪黑素浓度呈正相关，0.20 mmol/L 褪黑素处理效果最佳。

蛋白质泄漏量被认为是细胞膜损伤的另一项重要指标。 从图2C 可以看出，在整个培养时间内，不同浓度褪黑素处理和CK 的可溶性蛋白含量总体呈下降趋势。 与CK 相比，不同浓度褪黑素处理后的细胞外可溶性蛋白含量升高。 0.20 mmol/L 褪黑素处理的细胞外可溶性蛋白含量在4 h 时达到最大值(2.02 ± 0.0079 mg/mL)。 因此，不同浓度褪黑素处理可显著提高细胞外可溶性蛋白含量，且0.20 mmol/L 褪黑素处理效果更优。

通过测定细胞氧化损伤标志物丙二醛(MDA)的含量可检测病原菌丝体的脂质过氧化程度。 从图2D 可以看出，不同浓度褪黑素处理和CK 的菌丝体MDA 含量总体呈先上升后下降趋势。 与CK 相比，培养4、12、24 h 不同浓度褪黑素处理的菌丝体MDA 含量显著升高。 褪黑素处理的菌丝体MDA 含量在12 h 时达到最大值，之后开始下降并趋于稳定。

以上结果表明，褪黑素处理导致灰霉菌细胞膜损伤，细胞膜通透性增加。

2.5 褪黑素处理对贮藏期猕猴桃果实营养品质的影响

从图3A 可以看出，除了第10 天，0.10 mmol/L褪黑素处理的猕猴桃果实可溶性固形物(SSC)含量均与CK 无显著差异；与CK 相比，0.10 mmol/L褪黑素处理的抗坏血酸(ASA)含量除了在2 d 和10 d 有显著差异外，其余时间段无明显差异(图3B)；可滴定酸(TA)含量在4 d 和8 d 存在显著差异，其余时间段无显著差异(图3C)；还原糖含量在6 d 和8 d 出现显著差异(图3D)。 综合分析，0.10 mmol/L 褪黑素处理对猕猴桃果实营养品质无不良影响。

图3 褪黑素处理下贮藏期猕猴桃果实品质相关指标的变化

3 讨论与结论

猕猴桃具有重要的经济价值，采后猕猴桃由于运输中的机械损伤、病菌侵袭、生理性疾病等因素易发生腐烂、病害等情况，使其失去食用价值。已有研究证明，采后褪黑素处理可以抑制水稻白叶枯病的生长[19]，唐琦[20]研究发现，褪黑素对青霉病的生长有抑制作用，集中表现在对病菌菌落直径和孢子萌发两个方面。 本研究结果表明，0.10 mmol/L 褪黑素处理下的灰霉菌病斑直径最小，所以，褪黑素处理对灰霉菌的生长菌落有显著抑制作用；同时，褪黑素处理可明显抑制灰霉菌孢子的萌发、芽孢管长，从而影响灰霉菌菌丝生长，说明褪黑素处理能够在体外控制灰霉菌生长和分生孢子萌发，其中，0.20 mmol/L 褪黑素处理抑制孢子萌发的效果最佳；褪黑素处理能够显著降低贮藏期猕猴桃果实灰霉病的发病率，曹晶晶等[21]的研究中也得到类似结果。

生物激发子通过破坏细胞膜的通透性和结构或使关键细胞成分泄漏，如核酸或蛋白质，从而直接或间接地作用于真菌细胞膜[22]。 相对电导率、丙二醛含量、核酸和可溶性蛋白渗透量可用于评估细胞膜损伤程度[23]。 本研究表明，褪黑素处理增加了灰霉菌的相对电导率和MDA 含量，破坏了细胞膜的结构，使得细胞膜通透性发生改变，从而导致可溶性蛋白和核酸从细胞膜中释放出来，其中0.10～0.20 mmol/L 褪黑素处理效果较为明显。 有学者发现Bacillus pumilusHR10 破坏了病原菌细胞膜的完整性，影响了其生理细胞成分的产生[24]。 Wang 等[22]发现，在细胞膜被抗菌物质破坏的情况下，细胞膜的通透性会产生变化，随后释放细胞内的大分子蛋白。

猕猴桃果实在采摘后仍会进行一系列代谢过程，如能量代谢、呼吸消耗等，果实中的可溶性固形物、抗坏血酸、可滴定酸和还原糖含量的变化可用来评价果实营养品质的好坏[25-29]。 余巧银等[30]研究发现，拮抗酵母(P.membranaefaciens)能在降低西兰花发病率的同时，较好地维持果实营养品质，且无不良影响。 赵鲁宁等[31]的研究结果表明，季也蒙毕赤酵母Y35-1 菌株不同制剂能够有效降低采后枇杷炭疽病的发病率，并且对采后枇杷的果实营养品质也起到一定的维持作用。本研究表明，0.10 mmol/L 褪黑素处理能有效维持贮藏期间猕猴桃果实中的TA、ASA、SSC 和还原糖的含量。 因此，0.10 mmol/L 褪黑素处理采后猕猴桃果实不会对其营养品质产生不良影响。

综上所述，褪黑素处理可有效抑制灰霉菌病斑直径的增长，抑制灰霉孢子的萌发和芽孢管长度的增长，显著降低贮藏期猕猴桃果实灰霉病的发病率，增加灰霉菌细胞膜的通透性，维持贮藏期间猕猴桃果实品质。 综合分析，0.10 ～0.20 mmol/L的褪黑素处理对猕猴桃采后灰霉病有显著的抑制效果。 考虑到褪黑素的成本以及过高的褪黑素浓度可能存在一定负面影响等多种因素，在实际生产应用当中，推荐0.10 mmol/L 为最佳褪黑素使用浓度。