野樱莓果酒酿造工艺优化及抗氧化活性分析

汪娣，曾雪莹，胡玉清，李楠

广西大学生命科学与技术学院（南宁 530004）

野樱莓（Aronia melanocarpa）又名不老莓、黑果腺肋花楸，是来源于北美洲东部湿树林和加拿大东部的一种落叶灌木，属于蔷薇科类[1]。野樱莓果实中含有许多对人体有益的物质，包括维生素、叶酸、奎宁酸、多酚酸、单宁、儿茶素、橙皮苷和花青素等[2]。同时野樱莓果实含有丰富的黄酮类，也含有酚类中像花色苷一样的化合物，使得野樱莓具有较强的抗氧化活性，能够清除多种氧自由基，在抗癌、抗炎、降血糖以及心脑血管等疾病方面具有良好的药理作用[3-4]。甘蔗作为能量提供者，含有大量糖分，其中的铁可以缓和人体缺铁性的贫血[5]。与野樱莓相似，甘蔗具有较强的抵抗突变、氧化和炎症的能力，因为含有黄酮类、多酚类、单宁及多糖等多种具有生物活性的化合物，甘蔗也能降低人类患心脑血管疾病的概率，以此强身健体[6]。

近年来，具备保健功能的低醇度果酒越来越受到消费者的欢迎，研制此类果酒具有良好的市场前景。野樱莓中含有丰富的生物活性成分，能与蓝莓相媲美，具有酿造时间短一大特点，利用野樱莓酿造出的果酒颜色透亮，营养丰富、口感醇厚、风味独特。然而，对于野樱莓的产品开发较少，缺乏系统研究，且野樱莓中不含可发酵糖，甘蔗汁具有充分糖分和营养价值以增加果酒风味和特色。因此，试验以野樱莓为原料，利用甘蔗汁为发酵糖酿制果酒，整合双方的营养功能，优化其发酵工艺条件，主要对果酒的抗氧化成分进行提取和研究，创新果酒类别，同时拓宽野樱莓和甘蔗产业的应用范围[7]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野樱莓、白砂糖（市售）；酿酒酵母（安琪酵母股份有限公司）；甘蔗（广西农业科学院实验基地提供）；果胶酶（50 000 U/g，南宁庞博生物技术有限公司）；偏重亚硫酸钾（上海麦克林生化科技有限公司）；氢氧化钠（天津博迪化工股份有限公司）；柠檬酸（南宁恒因生物科技有限公司）；DPPH（美国Sigma公司）；无水乙醇（成都市科隆化工试剂厂）；铁氰化钾（国药集团化学试剂有限公司）；三氯化铁（台山市化工厂有限公司）；三氯乙酸（成都市科隆化工试剂厂）；磷酸二氢钠（天津市大茂化学试剂厂）；磷酸氢二钠（天津博迪化工股份有限公司）。所有试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

JJ-2组织捣碎机（上海菁华科技仪器有限公司）；PAL-1日本爱拓迷你数显折射计（广州爱拓科学仪器有限公司）；PHS-3E雷磁pH计、TW-12恒温水浴锅（上海仪电科学仪器股份有限公司）；UVmini-1240紫外-可见分光光度计[岛津仪器（苏州）有限公司]；SHP-250生化培养箱（优博莱技术有限公司）；PL-303电子分析天平（上海精宏实验设备有限公司）；TGL-20M高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 野樱莓果酒制备工艺与操作要点[9-11]

1.3.1.1 工艺流程

野樱莓→挑选→去梗去枝→清洗→破碎→酶解→榨取甘蔗汁同时调整糖度、pH→主发酵→过滤→后发酵→澄清→陈酿→野樱莓果酒

1.3.1.2 操作要点

原料的选取：选取形态饱满、深紫色、无虫蝇叮咬的野樱莓；选取多汁新鲜且无虫害的甘蔗；均储存于-20 ℃冰箱备用。

预处理、破碎：野樱莓和甘蔗清洗干净，将甘蔗破碎榨汁储存于-20 ℃冰箱备用，将野樱莓去梗破碎打浆。

酶解：将野樱莓和甘蔗汁按照7∶25（g/mL）的料水比混合，按质量比加入0.3%的果胶酶，在40 ℃条件下酶解3 h。

调整糖度、pH：添加白砂糖或蔗糖用来调整发酵液糖度至26.0 °Bx，用无水柠檬酸和碱性液体调整发酵液的pH至4.0。

主发酵：添加偏重亚硫酸钾，使二氧化硫浓度30mg/kg进行杀菌；按照1 g/100 mL的接种量进行接种，搅拌均匀，封闭置于28 ℃的培养箱恒温发酵9 d。

后发酵、澄清：将主发酵后的果酒滤液除渣，继续将果酒密封处理，发酵完全，澄清得到初成品。

陈酿：果酒继续密封保存可使果体更澄清，果味更醇厚。

1.3.2 野樱莓果酒酿造单因素试验设计

分别在野樱莓添加量（16，20，24，28和32 g）、发酵温度（24，26，28，30和32 ℃）、酵母接种量（0.6%，0.8%，1.0%，1.2%和1.4%）条件下，对野樱莓果酒的感官评分和酒精度等评价指标进行测定，确定最适宜的发酵条件。

1.3.3 野樱莓果酒酿造正交试验设计

在野樱莓果酒酿造单因素试验的基础上，选择发酵温度（A）、野樱莓添加量（B）和酵母添加量（C）为影响因素，以酒精度为评价指标，设计三因素三水平正交试验，筛选野樱莓果酒酿造的最适发酵条件[12]。设计正交试验的因素与水平如表1所示。

表1 野樱莓果酒发酵工艺优化正交试验因素与水平

1.3.4 测定方法

1.3.4.1 基本理化指标的测定

乙醇体积分数的测定按照GB/T 5009.48——2003《蒸馏酒与配制酒卫生标准的分析方法》；总酸含量测定均参照GB/T 15038——2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；总酚采用Folin-Ciocalte比色方法[13]测定；还原糖含量采用3, 5-二硝基水杨酸法[14]测定；总黄酮采用硝酸铝比色法[15]测定。

1.3.4.2 野樱莓果酒抗氧化活性分析

测定野樱莓果汁、野樱莓果酒及0.3 g/L VC的DPPH自由基清除能力和总还原能力，探究其抗氧化活性。

DPPH自由基清除率的测定参考文献[16-19]的方法，略有修改。分别准确移取0.6 mL不同体积分数（1%，2%，3%，4%，5%和6%）的样品溶液，取5 mL 60 μmol/L的DPPH乙醇溶液加入其中，混匀，常温避光30 min，在4 000 r/min、4 ℃的条件下离心10 min，取上清液，测定吸光度（波长517 nm）A1；将0.6 mL无水乙醇和5 mL DPPH乙醇溶液混匀，按上述方法测定吸光度A3；将5 mL无水乙醇和0.6 mL样品水溶液混匀，按上述方法测定吸光度A2。DPPH自由基清除率按式（1）计算。

总还原能力的测定参考文献[20-22]的方法，略有改动。分别取1 mL不同体积分数样液（5%，10%，15%，20%，25%和30%），加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸缓冲液，混匀，加入2.5 mL的1%铁氰化钾溶液。于50 ℃反应20 min，迅速放入低温冷却，加入1 mL 10%三氯乙酸，终止反应，在4 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，取2.5 mL上清液，按顺序加入2.5mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液，摇匀，静置5 min，测定吸光度（波长700 nm）。

1.3.5 感官评定

选择有感官评定经验的专家，男女共10名，组成野樱桃果酒的感官评价小组。标准从色泽（20分）、气味（30分）、滋味（40分）和典型性（10分）4个方面进行评定；参照GB/T 15038——2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》制定感官评分细则[23]，评分标准详见表2，取百分制，最终评分结果为平均值。

表2 野樱莓果酒感官评分标准

1.3.6 数据分析

使用Excel 2010整合试验数据，平行3次试验以保证数据客观；使用SPSS 26.0软件进行统计分析，使用Origin 2017制图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 发酵温度对野樱莓果酒品质的影响

由图1可见，随着发酵温度的增加，酒精度先趋于增加，后减少，在28 ℃时获得最高的酒精度和感官评分。在24 ℃的发酵温度下，成品野樱莓果酒的酒精度为16.8%vol，感官评分为78.5分，此时果酒未发酵完全，果味浓郁，但是酒味略显单薄，口味酸涩，主要原因可能是发酵温度较低，微生物利用糖分产生较多的酸类物质，产生乙醇较少，同时此种情况下导致酵母活性较低，从而使得发酵速度较慢，果酒发酵不完全。发酵温度升高至28 ℃时果酒酒精度达到最高，为17.4%vol，感官评分也居于最高，为87.4分，与孙天利等[24]发酵结果类似，结果表明此温度下微生物繁殖迅速，发酵适中，酒香浓厚，但当温度持续升高时，超过最适温度会抑制微生物繁殖，导致发酵不充分，果酒异味增加，酒精度降低。因此，最适合野樱莓果酒的发酵温度为28 ℃。

图1 发酵温度对野樱莓果酒品质的影响

2.1.2 野樱莓添加量对果酒品质的影响

由图2可知，在野樱莓添加量28 g时，酒精度和感官评价达到最高。野樱莓添加量16 g时，感官评分较低，为73.3分，口感风味较差。野樱莓添加量持续增加到28 g时，酒精度到达峰值17.2%vol，感官评分也达到峰值89.2分。而随着野樱莓添加量继续升高，果酒感官评分降低，与尚宏远等[25]研究芒果苹果复合果酒的结果一致。因此，最适合果酒的野樱莓添加量为28 g。

图2 野樱莓添加量对野樱莓果酒品质的影响

2.1.3 酵母添加量对果酒品质的影响

由图3可知，野樱莓果酒的酵母接种量1%时，酒精度达到峰值，感官评分适中。酵母接种量低于1%时，酵母活性低导致果酒不能充分发酵，因此果酒中的糖分不能被全部转化，从而酒精度低。而酵母添加量持续增加时，酵母含量越高，酵母的转化率变低，从而酒精度降低，感官评分降低[26]。因此，最适合野樱莓果酒的酵母添加量为1%。

图3 酵母添加量对野樱莓果酒品质的影响

2.2 野樱莓果酒酿造工艺优化正交试验结果与分析

由表3可知，各个因素对野樱莓果酒酒精度的影响主次顺序依次为B＞C＞A，即野樱莓添加量＞酵母添加量＞发酵温度，其中野樱莓添加量对野樱莓果酒的发酵影响显著，说明在发酵过程，野樱莓添加量对酒精发酵品质影响最大，地位最重要。从k值大小可知，工艺的最佳组合为A2B3C2，即发酵温度28 ℃、野樱莓添加量28 g、酵母添加量1.0%，由于试验没有A2B3C2的组合，在最优条件下，进行3次试验进行验证，与谢春阳等[27]研究结果相似，发酵结束后的野樱莓果酒酒精度为17.5%vol，感官评分为92.1分。

表3 野樱莓果酒发酵条件优化正交试验结果与分析

表4 误差分析表

2.3 野樱莓果酒成品检测结果及分析

野樱莓果酒澄清透明，颜色浅紫色有光泽，无悬浮物及沉淀；有明显的野樱莓果香，酒香自然；酸甜协调，柔和爽口，风格明显。理化和微生物指标检测结果见表5。按最优工艺条件发酵的野樱莓果酒的理化指标及微生物量均符合GB 2758——2012《发酵酒及其配制酒》[28]。

表5 野樱莓果酒理化及微生物指标检测结果

2.4 野樱莓果酒抗氧化能力

野樱莓果酒、野樱莓果汁及0.3 g/L VC对DPPH自由基的清除能力和总还原能力的测定结果见图4。

图4 不同样品清除DPPH自由基（A）及总还原能力（B）的能力

由图4（A）可知，野樱莓果酒、野樱莓果汁及0.3 g/L VC对DPPH自由基的清除作用均随着浓度的增加而增强，但增长的速率有所不同，具有良好线性关系。体积分数6%时，不同样品DPPH自由基清除率排序为野樱莓果酒（91.76%）＞野樱莓果汁（64.85%）＞0.3 g/L VC（8.51%），野樱莓果酒清除率最高，抗氧化能力明显比野樱莓果汁好，说明相比较自然果汁，发酵可使活性成分更好地发挥作用并溶出，表明野樱莓果酒可有效清除DPPH自由基。

由图4（B）可知，野樱莓果酒、野樱莓果汁及0.3 g/L VC的还原能力随样品用量的增加三者均呈现上升趋势。在试验范围内，2种样品的还原能力均优于0.3 g/L VC，且样品体积30%时，野樱莓果汁还原能力是0.3 g/L VC的44.45%，野樱莓果酒还原能力与0.3 g/L VC相当。这说明野樱莓果酒具有良好的还原能力。

3 结论与讨论

运用单因素试验，在结合正交试验设计的基础上分析得出野樱莓果酒酿造的最优工艺参数：野樱莓添加量28 g、发酵温度28 ℃、酵母添加量1%。此条件下得到的果酒酒精度为17.5%vol，果酒颜色澄清透明、酒香浓郁、入口微酸，感官评分为92.1分，各项理化及微生物指标均符合食品安全国家标准。野樱莓成品果酒富含黄酮，对比其他2类样品的DPPH自由基清除能力和总还原能力，均反映果酒具有较好的抗氧化活性。试验为野樱莓的应用开阔了前景，也为利用甘蔗汁的发酵增加新思路。