基于网络药理学和动物实验的痴呆健脑方治疗血管性痴呆作用机制研究*

伊文刚,董新刚,董晓坤,李伟峰

1.河南省洛阳正骨医院,河南 洛阳 471002; 2.河南中医药大学第一附属医院,河南 郑州 450000; 3.河南中医药大学,河南 郑州 450046

血管性痴呆(vascular dementia,VD)是缺血或出血性脑血管病引起脑组织损伤所致的痴呆类型[1]。作为影响老龄人群体健康的重要疾病,本病患病率伴随着中国人口老龄化持续加剧和其他潜在危险因素而呈逐年上升态势,如脑血管病、糖尿病及肥胖等代谢综合征患病人群日益增多[2-3]。中医认为,本病发病部位在脑,与心、肝、肾等脏器密切相关,肾精亏虚、痰浊内阻、瘀血阻滞乃日久损髓伤脑的主因,故本病基本病机为肾虚、瘀血、痰浊凝滞经脉[4]。痴呆健脑方是依据“三元络脑”学说拟定,该方由薯蓣丸和通窍活血汤的合方化裁而成,方中诸药合用,共起益肾填髓、涤痰开窍和祛瘀通络之功[4]。痴呆健脑方是全国老中医药专家学术经验继承工作指导老师经验方,初步临床验证效果良好[5-6]。为进一步明确痴呆健脑方对血管性痴呆的干预机制,本研究基于网络药理学探讨痴呆健脑方的作用机制,并辅以动物实验验证,以期为后续临床与实验研究提供参考。

1 网络药理学分析

1.1 资料与方法

1.1.1 痴呆健脑方活性成分检索在中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)依次检索熟地黄、山茱萸、肉桂、茯苓、桃仁、川芎、石菖蒲、党参、白术、生姜等各自活性成分,按照口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且类药性(drug-likeness,DL)≥0.18为标准筛选;使用SwissADME筛选在化源网上获取的远志的活性成分。痴呆健脑方有效活性成分通过Drugbank数据库进一步预测潜在靶点。

1.1.2 血管性痴呆靶点收集在在线人类孟德尔遗传数据库(online mendelian inheritance in man,OMIM)及GeneCards数据库以“vascular dementia(VD)”为关键词进行检索,获取血管性痴呆相关靶点。

1.1.3 Venn图构建依据Venn2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)在线平台取药物靶点和疾病靶点的交集,获取痴呆健脑方治疗血管性痴呆的潜在靶点,并以Venn图显示。

1.1.4 构制“药物-活性成分-靶点”网络图将痴呆健脑方药物组成、活性成分及对应靶点进行映射,运用Cytoscape3.8.2软件构制“药物-活性成分-靶点”网络图。

1.1.5 蛋白质互作(protein-protein interaction networks,PPI)网络图构建把药物和疾病的交集靶点导入STRING(https://string-db.org/)在线数据库,物种设置为“Homo sapiens”,构建交集靶点PPI网络图。

1.1.6 基因本体(gene ontology,GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信号通路富集分析把药物和疾病的交集靶点导入Metascape(https://metascape.org/gp/index.html)在线数据库,把物种设置为“Homo sapiens”,进行GO富集分析,得到痴呆健脑方对血管性痴呆的生物功能注释,包括生物过程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、细胞组成(cellular component,CC),同时进行数据可视化处理。以相同方法进行KEGG通路富集分析,得到痴呆健脑方作用于血管性痴呆的主要通路,结果以表格形式展现。

1.2 结果

1.2.1 痴呆健脑方活性成分对应靶点及血管性痴呆相关靶点的获取在TCMSP数据库检索痴呆健脑方的药物活性成分,按照OB≥30%和DL≥0.18标准筛选,获得痴呆健脑方有效活性成119个,其中白术21个、川芎7个、党参21个、茯苓15个、肉桂10个、山茱萸20个、生姜5个、石菖蒲4个、熟地黄2个、桃仁23个;化源网检索远志26个,经SwissADME筛选后剩余有效活性成分5个。根据筛选得到的活性成分,从Drugbank数据库中提取每个活性成分的潜在作用靶点信息,进一步利用UniProt数据库(http://www.uniprot.org/)检索得到靶点对应的基因名,获得痴呆健脑方活性成分潜在作用靶点208个。利用OMIM和GeneCards数据库共预测得到血管性痴呆相关靶点133个。

1.2.2 药物和疾病交集靶点Venn图将痴呆健脑方活性成分靶点映射到血管性痴呆靶点中,得到交集靶点10个。见图1。

图1 潜在靶点韦恩图

1.2.3 “药物-活性成分-靶点”网络图利用Cytoscape 3.8.2软件构制“药物-活性成分-靶点”网络图,图中显示节点337个,其中药物活性成分119个、药物节点10个(熟地黄成分有两个且均为共同成分,未显示)、靶点节点208个,见图2。图中浅蓝色为靶点,RG为肉桂活性成分,DS为党参活性成分,BZ为白术活性成分,SDH为熟地黄活性成分,SJ为生姜活性成分,SZY为山茱萸活性成分,SCP为石菖蒲活性成分,FL为茯苓活性成分,CX为川芎活性成分,TR为桃仁活性成分,A1、B1、C1、D1为共同成分。

图2 “药物-活性成分-靶点”网络图

1.2.4 PPI网络图将药物和疾病交集靶点传至STRING数据库,构建蛋白间相互作用关系网络图,其中节点为靶蛋白,边为靶蛋白间相互作用关系。见图3。

图3 潜在靶点PPI网络图

1.2.5 GO功能富集分析利用Metascape数据库对痴呆健脑方作用于血管性痴呆的有效作用靶点进行GO功能富集分析,得到GO条目867条,其中BP 730条、MF 90条、CC 47条,选择前20条作图。由BP分析结果可知,痴呆健脑方对血管性痴呆的治疗作用主要与对异种物质刺激的发应(response to xenobiotic stimulus)、异种物质分解代谢过程(xenobiotic catabolic process)、单萜类代谢过程(monoterpenoid metabolic process)等生物过程有关。MF分析表明共同靶点主要涉及氧化还原酶活性(oxidoreductase activity)、单加氧酶活性(monooxygenase activity)、花生四烯乙醇胺8,9环氧氧化酶活性(anandamide 8,9 epoxidase activity)等分子功能。基于CC分析结果,突出后膜(postsynaptic membrane)、树突(dendrite)及突出膜(synaptic membrane)等细胞组分在痴呆健脑方对血管性痴呆的治疗过程中发挥关键作用。见图4—图6。

图5 潜在靶点MF分析

图6 潜在靶点CC分析

1.2.6 KEGG通路富集分析运用Metascape在线数据库对痴呆健脑方治疗血管性痴呆有效作用靶点进行KEGG通路富集分析,筛选标准为P<0.05及FDR<0.05,取前20条通路。分析显示,共同靶点主要富集于AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、NF-κB信号通路和MAPK信号通路等。见表1。

表1 KEGG富集分析结果

2 动物实验

2.1 材料

2.1.1 实验动物SD雄性健康大鼠100只,体质量(250±20)g,动物许可证号:SCXK(豫)2020-0010,购于郑州市惠济区华兴实验动物养殖场,饲养于河南省中医院动物实验中心,相关动物实验经河南省中医院动物实验中心伦理委员会批准,实验操作均符合有关实验动物福利和伦理规范,福利伦理审查批准编号:DWLL20200156。

2.1.2 药物与试剂熟地黄、山茱萸、肉桂、远志、茯苓、桃仁、川芎、石菖蒲、党参、白术、生姜饮片来自河南省中医院药剂科;盐酸多奈哌齐片[商品名:安理申,卫材(中国)药业有限公司,规格:10 mg,国药准字:H20070181]。白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)ELISA试剂盒、IL-6 ELISA试剂盒、IL-18 ELISA试剂盒、TNF-α ELISA试剂盒、NF-κB抗体、p65/p50抗体(英国Abcam公司,货号:ab255730、ab178013、ab215539、ab181421、ab16502、ab131546);荧光二抗(美国Proteintech公司,货号:SA00007-2)。

2.1.3 仪器TGL-16M型台式高速冷冻离心机(济南欧莱博科学仪器有限公司);MultiSkan3型酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司);Mini P-4型电泳槽、VE-186型湿转电泳槽、5200型全自动化学发光成像分析系统(上海天能科技有限公司);Mini-Sbucell GT型电泳仪(美国Bio-Rad公司);XK-802型水平脱色摇床(江苏新康医疗器械有限公司);pH211型酸度计(意大利Hanna公司);F10型电动组织匀浆器(美国Fluka公司)。

2.2 方法

2.2.1 动物造模采用改良双侧颈总动脉分次结扎法建立VD模型。术前禁食水12 h,称大鼠质量,腹腔注射10%水合氯醛(3 mL·kg-1)进行麻醉,麻醉成功后将大鼠仰卧固定于手术台上,取颈正中切1.5～2.0 cm切口,钝性分离皮下软组织及肌层,充分暴露右侧颈总动脉和迷走神经,用1号手术线将右侧颈总动脉永久性结扎,伤口缝合3 d后拆线;腹腔注射庆大霉素 0.05 mL,每天1次,连续5 d;左侧颈动脉结扎同上。假手术组仅做麻醉和颈总动脉分离,不结扎。术后自由获取水源及饲料,适应性喂养1周后采用水迷宫筛选实验动物,首次跨越平台时间明显延长、跨越平台次数明显少于正常大鼠者为造模成功。

2.2.2 药物干预将造模成功的大鼠采用随机数字表法进行分组,分为模型组、多奈哌剂组及痴呆健脑方高、低剂量组。假手术组和模型组以生理盐水灌胃;多奈哌齐组以3 mg·kg-1剂量灌胃盐酸多奈哌齐,痴呆健脑方高、低剂量组分别以32 g·kg-1、16 g·kg-1灌胃,药物给药剂量按人和动物体表面积折算的等效剂量比较表换算,各组连续干预1个月。

2.2.3 空间学习记忆能力考察干预1个月后,Morris水迷宫检测大鼠空间学习记忆能力,包括定位航行实验及空间探索实验。实验前应完善准备工作,水的高度为高过站台0.5～1.0 cm,池子水温保持在24 ℃左右,最后加入奶粉使水变浑浊,以看不见台子为准,并在水迷宫上固定标记物。实验前 30 min 让动物熟悉实验环境。把实验大鼠依次编号,实验期间按照固定顺序实验,不能更改。取出实验大鼠按照顺序依次从水迷宫第一象限面向池壁放入水中,然后开始记录,保证周围环境的稳定。设置软件记录时间为1 min,当实验大鼠到达站台并上台停留3 s则视为找到台子,录像自动停止,若实验小鼠没有找到台子则1 min自动停止。当小鼠没有找到台子,实验人员应在录像停止后引导实验小鼠上站台,让其在台子上停留 30 s 以熟悉周边环境。前5 d训练,从第一象限开始,当实验大鼠依次做完一遍,然后按照同样要求在第二、三、四象限重复实验,共做4遍。第6天实验需撤掉站台,然后选择站台所在象限的对侧象限为入水点,只做1次,数据采集完成后使用软件进行分析。

2.2.4 炎性因子检测按照试剂盒操作说明,用酶联免疫吸附实验测定各指标的水平。IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α的可测范围分别为4～500 ng·L-1、30～4 000 ng·L-1、15～2 000 ng·L-1和2～200 ng·L-1,重复3次实验。

2.2.5 NF-κB、p65/p50蛋白表达检测运用Western blot法检测NF-κB、p65/p50蛋白的表达水平。取大鼠海马组织,利用RIPA细胞裂解液(含PMSF和磷酸酶抑制剂)进行裂解,采用BCA法进行蛋白定量测定后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳结束后使用湿转法将样本转印至硝酸纤维素膜上,室温下5%脱脂奶粉封闭2 h,一抗按照1：1 000比例进行稀释,4 ℃孵育过夜,使用缓冲液重复洗涤3次,每次10 min,然后按照1：5 000 比例配置HRP标记的二抗稀释液,将条带置于二抗,室温孵育2 h后,使用缓冲液重复洗涤三次,每次10 min,按照化学发光试剂盒说明书的步骤进行显影,利用凝胶成像系统进行成像检测,并用图像处理软件Gelpro32对条带进行光密度分析。

2.3 结果

2.3.1 空间学习记忆能力实验结果比较与假手术组比较,模型组逃避潜伏期明显延长(P<0.05),穿越平台次数明显减少(P<0.05),目标象限时间比明显较小(P<0.05)。与模型组比较,多奈哌齐组及痴呆健脑方高、低剂量组逃避潜伏期明显缩短(P<0.05),穿越平台次数明显增加(P<0.05),目标象限时间比明显较大(P<0.05);痴呆健脑方高剂量组和低剂量组之间各项指标比较差异不明显(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠空间学习记忆能力对比

2.3.2 海马区炎性因子水平比较与假手术组比较,模型组大鼠海马区IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α炎性因子水平均明显升高(P<0.05)。与模型组比较,多奈哌齐组及痴呆健脑方高、低剂量组海马区IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α炎性因子水平均明显降低(P<0.05);痴呆健脑方高剂量组和痴呆健脑方低剂量组IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α各项指标比较差异不明显,差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠海马区IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平比较

2.3.3 NF-κB、p65/p50表达水平比较与假手术组比较,模型组大鼠海马区NF-κB、p65/p50蛋白水平明显升高(P<0.05)。与模型组比较,多奈哌齐组及痴呆健脑方高、低剂量组大鼠海马区 NF-κB、p65/p50蛋白表达水平明显降低(P<0.05);痴呆健脑方高剂量组与痴呆健脑方低剂量组NF-κB、p65/p50蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表4,图7。

表4 各组大鼠海马区NF-κB、p65/p50蛋白水平比较

图7 蛋白表达条带图

3 讨论

血管性痴呆属中医学“呆病”范畴,《杂病源流犀烛·中风源流》“中风后善忘”是有关本病的较早记载[7]。《类证治裁》载“血瘀于内,则善忘如狂”,即瘀血阻滞脑脉而致脑失充养,神灵失用,则发为痴呆[8]。血管性痴呆与心、肝、脾、肾等脏腑功能失调相关,其发病与年龄、情志、痰浊和瘀血关系密切,为本虚标实之证[9]。目前,血管性痴呆西医治疗以预防和改善症状为主,尚无针对本病病理干预的药物用于临床,作为中西医协同攻关优势病种,中医药治疗本病优势逐渐彰显[10-11]。痴呆健脑方是全国名老中医药专家学术经验继承工作指导老师临床经验方,方中诸药合用,共奏益肾填髓、涤痰开窍和祛瘀通络之功[4]。前期临床小样本研究已初见成效[12],但其治疗本病的有效物质基础和作用机理尚需进一步探究。

本次网络药理学研究显示,痴呆健脑方活性成分相关靶点与血管性痴呆相关靶点的交集靶点10个;富集分析获取GO条目867条,其中生物过程730条、分子功能90条、细胞组分47条;KEGG富集获取通路26条;参与的信号通路主要为MAPK、PI3K-Akt、TNF和NF-κB等信号通路。

鉴于网络药理学研究的局限性,本研究同时以改良双侧颈总动脉分次结扎法[12]制作动物模型进行了实验验证研究。采用Morris水迷宫对大鼠空间学习与记忆能力进行检测[13],结果显示,与模型组比较,痴呆健脑方高、低剂量组逃避潜伏期明显缩短,穿越平台次数明显增加,目标象限时间比明显升高,提示该药能有效提升血管性痴呆大鼠空间位置感和方向感。

血管性痴呆发病机制虽不十分明确,但炎症反应机制却备受关注[14-15],过度炎症反应可导致神经元、神经胶质细胞死亡,触发炎症级联反应,加剧本病发展;抑制炎症反应则有助于神经元细胞存活,改善临床症状与预后[16]。研究证实,通过抑制VD大鼠海马区小胶质细胞活化,降低IL-1β、IL-18、TNF-α等因子释放,可减轻海马神经细胞损害,改善学习记忆能力[17-19]。本研究显示,与模型组比较,痴呆健脑方高、低剂量组大鼠海马区IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α等炎性因子水平降低明显,提示痴呆健脑方可通过降低海马区炎性因子表达水平改善血管性痴呆临床症状。

NF-κB主要由p65、p50的两个亚基以同源或异源二聚体形式组成的转录因子,可以控制DNA转录、细胞因子产生和细胞存活,广泛参与细胞对各种刺激的应答[20]。作为脑缺血损伤反应最早的关键炎症因子,NF-κB通过增强TNF-α、IL-1β等促炎症因子表达,间接促进炎症反应[21]。研究表明,NF-κB与脑内免疫和应激反应密切相关[22],当NF-κB 抑制剂浓度在脑外伤周围组织中明显升高时,可减轻继发性脑损伤并降低炎性细胞因子表达。抑制NF-κB信号通路,可减少神经炎症反应和内质网应激,保护神经元细胞功能,延缓血管性痴呆疾病进程[23]。本研究显示,与模型组比较,痴呆健脑方高、低剂量组大鼠海马区NF-κB、p65/p50蛋白表达水平明显降低。结合炎症因子检测结果,提示痴呆健脑方可通过调控NF-κB信号通路,抑制神经炎症反应发生发展,从而改善认知功能,这也进一步验证了网络药理学关于NF-κB信号通路作用机理的推测[24]。

本研究整合了疾病基因和药物PPI网络数据,对痴呆健脑方治疗血管性痴呆关键靶点进行了有效筛选和富集分析,明确了药物发挥疗效的潜在机制,并通过动物实验进一步验证了其疗效和作用机制。鉴于目前血管性痴呆患者样本数据相对较少,本研究也存在一定局限性。随着TCGA、GEO等大型疾病基因数据库快速建设,越来越多基因芯片信息将被整合到中药研究中,因此,持续深化痴呆健脑方治疗血管性痴呆关键靶点和作用机制,阐明痴呆健脑方对血管性痴呆深层保护机制仍然是今后研究的重点领域。