基于网络药理学和分子对接技术探讨陈皮-半夏药对治疗慢性支气管炎作用机制

关琴笑,廖嘉仪,张玉娥,李绮婷,谭娥玉,宋向岗

(1.江门市五邑中医院,广东 江门 529000;2.江门市药品检验所,广东 江门 529000)

慢性支气管炎(Chronic bronchitis,CB)是临床发病率较高的呼吸系统疾病之一,尤以老年人多发[1]。该病指气管、支气管黏膜及其周围组织的慢性非特异性炎症,每年至少3个月且连续2年的慢性咳嗽和咳痰[2],属于中医学咳嗽、痰饮、咳喘等疾病范畴。古人云:“脾为生痰之源,肺为贮痰之器”[3],形象地说明了肺、脾功能失调,影响津液输布与排泄,以致水湿内停,聚湿成痰,出现咳嗽、咳痰症状,也是现代疾病慢性支气管炎的病理基础,临床常使用理气健脾、燥湿化痰的中药治疗。

中药陈皮CitriReticulataePericarpium为芸香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培变种的干燥成熟果皮,药材分为陈皮和广陈皮,味苦、辛,归肺脾经,有理气健脾、燥湿化痰的功效,用于脘腹胀满,食少吐泻,咳嗽痰多。半夏PinelliaeRhizoma为天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.的干燥块茎,具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效,用于湿痰寒痰、咳喘痰多等症。陈皮-半夏两药常作为经典化痰药对配伍入复方[4],如二陈汤、温胆汤,共奏理气健脾、燥湿化痰行气之功,现代研究表明,两者可用于治疗慢性呼吸系统疾病[5-6],但有关这一药对治疗CB的药理学作用机制研究报道较少。本研究基于网络药理学,筛选陈皮-半夏药对的活性成分,预测活性成分的作用靶点和生物学信号通路,探讨陈皮-半夏药对治疗CB的潜在作用机制。

1 方法

1.1 陈皮-半夏化学成分和靶点收集

利用TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)及文献检索收集陈皮-半夏的化学成分,设置口服生物利用度(OB≥30%)和类药性(DL≥0.18)为筛选标准,结合文献筛选出活性成分。使用TCMSP、BATMAN-TCM、Drugbank(https://www.drugbank.ca/)数据库获得目标化合物的相关靶点,并利用Uniprot数据库对靶点进行标准化处理。

1.2 CB疾病靶点和与成分交集靶点收集

在GeneCards(http://www.genecards.org/)数据库中,以“chronic bronchitis”为搜索关键词,获得CB相关靶点,并归纳出药对和疾病的交集靶点。

1.3 “陈皮半夏-活性成分-靶点”网络关系构建及分析

将获得药对的活性成分及交集靶基因导入Cytoscape 3.7.2软件,构建可视化网络,直观地反映活性成分和靶点的关系。网络活性成分设置为长方形节点,靶点为椭圆形节点,节点之间连接次数越大,节度值(degree)越大,通过分析节度值和GeneCards数据库中CB相关系数,预测重要活性成分和靶点。

1.4 蛋白质互作(PPI)网络构建及核心靶点筛选

将交集靶点输入String数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl),物种限定为“Homosapiens”,相互作用阈值选定为0.7最高置信度,去除游离基因,构建PPI。边(edge)的颜色深浅设置反映关系程度,导出交集靶蛋白相互作用关系网络。通过分析网络的节度值(degree),获得PPI网络中的核心靶点。

1.5 功能富集和基因组百科全书通路富集分析

利用David 2021数据库(htpps://david.ncifcrf.gov/)对陈皮-半夏和CB交集靶点进行GO功能和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。

1.6 分子对接

从PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取“药物-活性成分-靶点”网络关系图中度值较高化合物的2D结构,将其导入Chem3D软件转换为3D结构,通过结构优化使其能量最小化并保存为mol2 格式;通过PDB数据库(https://www.rcsb.org/)下载PPI网络获取到的核心蛋白受体结构,并利用 Pymol 软件去水、去小分子配体,然后导入AutoDockTools软件进行加氢等预处理后,将活性成分、蛋白受体的格式转为*pdbqt 格式;最后利用Vina软件进行分子对接,验证其结合活性。

2 结果

2.1 化合物筛选

TCMSP数据库中同时符合OB≥30%和DL≥0.18的成分,陈皮有7个,半夏有12个。查阅资料和文献,陈皮中黄酮类和挥发油为其主要活性成分,且2020年版《中华人民共和国药典》对陈皮的黄酮类成分橙皮苷、橘皮素有含量测定要求,挥发油中柠檬烯、γ-萜品烯含量较高,邻甲氨基苯甲酸甲酯为广陈皮的特征性成分[7-9]。故将以上5种成分纳入分析,共筛选24个成分。见表1。

表1 陈皮-半夏化学成分信息

2.2 陈皮-半夏活性成分与CB的交集靶点

经整理,GeneCards数据库中CB涉及1 204个疾病靶点,相关性分数范围为0.21～61.04,中位数为4.83。目标活性成分共有331个靶点,其中91个为活性成分和CB的交集靶点。交集靶点在GeneCards数据库中CB相关性分数范围为0.82～45.48,中位数为7.79,70%交集靶点相关性>4.83,与疾病关系密切。TP53等11个靶点相关性分数>15(见表2),为陈皮-半夏治疗CB的相关性较高靶点。

表2 CB疾病高相关性靶点信息

2.3 “陈皮半夏-活性成分-靶点-CB”网络关系构建分析

可视化网络(见图1)中长方形代表陈皮-半夏中的 21种活性成分(去除无对应靶点的活性成分),椭圆形代表91个共同靶点,活性成分平均节度值为10.24,≥节度值15的成分(节度值)有柚皮素(21)、柠檬烯(19)、γ-萜品烯(18)、川陈皮素(17)、黄芩素(17)、β-谷甾醇(16)、橘皮素(15)。靶点平均节度值为2.36,PTGS2、SCN5A、PTGS1、ADRB2等节点节度值较大,4个及以上成分的交集靶点中,75%靶点相关性分数高于CB中位数(见表3)。从网络中可看出,陈皮-半夏不同类型组分通过作用于不同靶点发挥作用。

图1 “药物-活性成分-靶点”可视化网络

表3 4种及以上活性成分的交集靶点信息

2.4 靶蛋白互作网络分析

PPI网络(见图2),网络中靶点之间的连线代表靶点间存在相互作用,网络总边数为324,平均节度值为7.12,PPI富集P<1.0e-16。靶点的节度值越大,表示该靶点在网络中作用越关键,其中节度值>20的靶点(节度值)包括AKT1(26)、MAPK3(25)、TP53(25)、HSP90AA1(24)、JUN(24)、IL1B(21)、MAPK1(21)为核心靶点(见表4)。

图2 靶蛋白的PPI网络

表4 PPI网络中核心靶点

2.5 靶基因功能分析

以P≤0.01为截点,靶基因涉及229个生物过程条目,39个细胞组成条目,55个分子功能条目。生物过程涉及缺氧反应、脂多糖反应、药物反应、尼古丁反应、老化、外源刺激的反应、蛋白磷酸化正调控、一氧化氮生物合成过程的正调控、心室心肌细胞动作电位、凋亡过程的正向调控等;细胞组成涉及大分子配合物、细胞外间隙、细胞外区、细胞表面、膜筏、质膜、小窝、细胞外泌体、线粒体、肌膜等;分子功能涉及酶结合、血红素结合、相同的蛋白质结合、蛋白质同源二聚化活性、离子通道结合、支架蛋白结合、转录辅激活剂结合、蛋白结合、芳香酶活性、Hsp90蛋白结合等。见图3。

图3 GO生物学富集分析

2.6 靶基因信号通路分析

KEGG富集分析结果(见图4)以P≤0.01为截点,共获得通路117条通路,主要包括癌症通路、AGE-RAGE信号通路、化学致癌-受体激活、TNF信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路等。

图4 KEGG通路富集分析

2.7 分子对接结果

“药物-成分-靶点”网络关系图中度值较高化合物柚皮素、柠檬烯、γ-萜品烯、川陈皮素、黄芩素、β-谷甾醇、橘皮素分别与PPI网络的核心靶点AKT1(PDB ID:4EJN)、MAPK3(PDB ID:2ZOQ)、TP53(PDB ID:5AOM)、HSP90AA1(PDB ID:3O0I)、JUN(PDB ID:5T01)、IL1B(PDB ID:5R85)、MAPK1(PDB ID:6SLG)进行分子对接。根据文献报道,一般结合能分值≤-5.0kCal/mol,表示成分和靶点具有较好结合作用[10]。结果主要活性成分与核心靶点的结合能均小于-5.0kCal/mol,表明其具有较好的结合能力(见表5、图5)。

注:A.AKT1与川陈皮素;B.AKT1与黄芩素;C.AKT1与柚皮素;D.HSP90AA1与黄芩素;E.HSP90AA1与柚皮素;F.JUN与川陈皮素;G.JUN与黄芩素;H.MAPK1与黄芩素;I.MAPK3与黄芩素。

表5 活性化合物与核心靶点结合能

3 讨论

本研究利用TCMSP等数据库,研究了陈皮-半夏的活性成分治疗慢性支气管炎的分子机制,筛选出陈皮的黄酮、挥发油,半夏甾醇、黄酮多个物质基础。在活性成分-靶点网络中,柚皮素、柠檬烯、γ-萜品烯、川陈皮素、黄芩素、β-谷甾醇作用于较多靶点,为主要活性成分;AKT1、MAPK3、TP53、HSP90AA1、JUN、IL1B、MAPK1为PPI网络核心靶点。

柚皮素、川陈皮素、黄芩素为黄酮类成分,均具有抗炎的药理作用。Fouad等[11]表明,柚皮素能明显减轻LPS诱导急性肺损伤模型大鼠肺组织病理损伤,显著降低肺组织中TNF-α、caspase-3的表达,显著升高HSP70的表达。Chen等[12]研究发现,陈皮黄酮类成分川陈皮素具有良好的抗炎作用,减少促炎因子NO,抑制诱导型的iNOS和COX-2基因的表达。Duan等[13]研究表明,黄芩素显著抑制脂多糖LPS刺激的巨噬细胞系中炎性因子的TNF-α、IL-4和IL-6的表达。挥发油类成分柠檬烯、γ-萜品烯也具有抗炎作用。柠檬烯诱导的A2A腺苷受体激活可减少哮喘小鼠模型中的气道炎症和反应性[14];γ-萜品烯能减少卡拉胶诱导的腹膜炎模型动物的中性粒细胞迁移,以及IL-1β和TNF-α的产生[15]。此外,柠檬烯、γ-萜品烯具有抗氧化作用[16]。β-谷甾醇为甾醇类化合物,能减少卵蛋白诱导的哮喘小鼠模型中支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞,降低肺组织和BAL液中IL-4和IL-5[17]。

PTGS2、PTGS1为陈皮-半夏药对较多成分的相同靶点,慢性支气管疾病如哮喘与PTGS1和PTGS2基因的遗传变异有关[18]。Wu等[19]研究表明,川陈皮素的主要代谢物4′-Demethylnobiletin(4DN)具有一定的抗炎作用,4DN不仅剂量依赖性地抑制LPS诱导的NO的产生,显著降低促炎介质PGE2、IL-1β和 IL-6,在蛋白和mRNA水平上抑制iNOS和COX-2的表达,还抑制NF-κB和AP-1的核转位。ADRB2基因编码β2肾上腺素受体,主要分布于支气管平滑肌、血管平滑肌和心肌等,介导支气管平滑肌松弛,血管扩张等作用,β2受体激动剂治疗支气管炎、哮喘、慢性阻塞性肺炎等呼吸系统疾病疗效较好[20-21]。SCN5A、KCNH2属于电压门控通道,与慢性呼吸系统疾病相关的研究较少,Chatterjee等[22]研究肺内皮失去流体剪切应力(缺血)时,通过ATP敏感的K+通道关闭,引起内皮质膜去极化,启动信号级联,导致NOX2激活和ROS产生。其他多配体靶点还包括激素受体ESR1、AR,神经系统的CHRM3、ACHE等。研究表明,肺癌和慢性阻塞性肺病的发病率在女性中均显著增加,可能与生殖器官合成的雌激素以及局部肺雌激素合成,参与激活肺中多种细胞类型表达的雌激素受体有关,促进生长和肺部炎症表达[23-24]。

基于String数据库构建陈皮-半夏药对治疗CB靶点PPI网络,筛选出的核心基因有AKT1、MAPK3、TP53、HSP90AA1、JUN、IL1B、MAPK1等。AKT1基因编码的是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是PI3K/AKT信号通路中核心因子,研究表明,AKT1通过诱导巨噬细胞产生IL-13来调节肺纤维化[25]。MAPK基因编码丝裂原活化蛋白激酶,是信号从细胞表面传导至细胞核内部的重要传递者,能被不同的细胞外刺激,如细胞因子、激素、神经递质、细胞应激及细胞黏附等激活。研究发现,LPS激活慢性支气管炎大鼠巨噬细胞MAPK后,ERK和p38 MAPK抑制剂可显著抑制其巨噬细胞中COX-2和TGF-β的表达[26]。TP53基因是一种抑癌基因,Zhou等[27]研究发现,橙皮素能抑制AKT1、IL6、VEGFA、MMP9上调TP53蛋白表达,从而降低COPD发病风险进展为肺癌。HSP90AA1属于热休克蛋白,应激状态时帮助细胞维持正常的生理活动。Wang等[28]研究发现,HSP90AA1可能是慢性阻塞性肺疾病潜在的治疗靶点。

GO生物学富集结果主要集中于细胞对缺氧的反应、脂多糖的反应、药物的反应、尼古丁的反应、外源刺激的反应及老化等。KEGG 通路富集结果主要集中于AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路等。AGE-RAGE信号通路与炎症和抗氧化应激有关,在RAGE的各种配体中,晚期糖基化终末产物(AGEs)主要与慢性呼吸系统疾病COPD相关[29]。AGEs作用于GLUTag细胞,可上调细胞RAGE受体表达,激活NADPH 氧化酶,升高 p38MAPK磷酸化水平,促使NF-κB 因子表达,释放炎症因子,并调节细胞凋亡相关蛋白表达,从而导致细胞炎症损伤与凋亡[30]。TNF信号通路与炎症有关,半夏能抑制小鼠主动脉内皮细胞炎性因子TNF-α、IL-6的分泌[31];川陈皮素能通过抑制NF-κB和AKT1激活,来抑制TNF-介导的炎症反应[32]。MAPK信号通路与炎症和细胞凋亡有关,在慢性支气管炎的进程中,p38MAPK通路通过对肺泡巨噬细胞、中性粒细胞等多种细胞的作用、对炎症因子产生的调控、对酶的诱导,以及促进转录因子活化等机制来调节炎症过程的发生发展[33-35]。PI3K-Akt信号通路与炎症有关,实验研究证实,PI3K-Akt信号通路参与支气管炎、哮喘、慢性阻塞性肺炎、肺纤维化等呼吸系统疾病[36-38]。

综上,本研究基于网络药理学探讨陈皮-半夏药对治疗CB的潜在活性成分、关键靶点和信号通路。陈皮-半夏药对治疗CB的作用机制可能与其中所含的柚皮素、川陈皮素、黄芩素、柠檬烯、γ-萜品烯、β-谷甾醇、橘皮素等多种活性成分,通过调控AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路发挥治疗慢性支气管炎的作用相关,为分子机制研究提供了方向。