基于网络药理学探讨土家药飞龙掌血抗肝癌的潜在活性成分及作用机制

宋添力,刘立安,李 奇,刘 绪,黄 胜*

1.湖北民族大学医学部(湖北 恩施 445000) 2.世界中医药学会联合会(北京 100101) 3.北京中医药大学(北京 100105) 4.北京京都儿童医院(北京 102208)

原发性肝癌(PLC),包括肝细胞癌(HCC)和肝内胆管癌(ICC),是全球癌症相关死亡的重要来源。国家卫生健康委员会于2022年发布了最新的《原发性肝癌诊断和治疗指南》[2],建议对早期癌症进行肝切除术和移植,对晚期患者进行介入治疗和射频消融术。祖国医学中没有“肝癌”这个病名,但很多病名与肝癌密切相关,如“肝积”“癥瘕”“息贲”“肥气”“血鼓”等,其病因病机大多脏腑不通、气血不和、阴阳失调,外感六邪趁虚而入,与痰、热、淤、湿、气等搏结而成,其病理性质多为本虚标实[3]。飞龙掌血为芸香科飞龙掌血[Toddaliaasiatica(L.)Lam.]的根或根皮,又名散血飞、黄椒根等,其性温,味辛、微苦,归脾、胃经,是湖北、贵州、广西等省区的传统民族药,湖北恩施地区经常用水煎剂和药酒来治疗各类跌打损伤、痛症等,具有活血化瘀,祛风除湿,消肿散结的功效[4-5]。现代研究表明[6]飞龙掌血中主要由香豆素、生物碱、萜类、黄酮、酚酸等化学成分构成,其中生物碱是飞龙掌血发挥抗肿瘤作用最主要的活性成分,其通过阻滞肿瘤细胞周期,诱导肿瘤细胞凋亡,对多种肿瘤细胞有显著抑制作用。临床上飞龙掌血用于治疗肝癌效果较好,但目前关于其治疗肝癌的具体活性成分及作用机制尚不清楚,本课题组采用网络药理学方法和分子对接技术对土家药飞龙掌血抗肝癌的主要活性成分和潜在的靶点进行预测分析,探讨其作用机制,以期为后续深入研究提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 药物活性成分的筛选通过HERB本草组鉴(http://herb.ac.cn)、PubChem(pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)数据库查找飞龙掌血的活性成分及其对应的Smiles号,并将Smiles号输入Swiss ADME数据库(http://www.swissadme.ch/)对有效活性成分进行初步筛选,利用Swiss Target Prediction数据库(www.swisstargetpredicton.ch)对初步筛选后的活性成分进行靶点预测;并使用Uniport蛋白数据库(https://www.uniprot.org),对筛选的靶点进行信息标准化的校对及删除重复值。

1.2 疾病靶点和共有靶点的筛选利用DisGeNET数据库(https://disgenet.org)、NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和OMIM数据库(www.omim.org)以“Liver Cancer”为关键词,筛选相关的疾病靶点,合并4个数据库的靶点结果,删除重复值。通过在线作图平台微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)平台,将药物活性成分靶点与疾病靶点取交集,得到药物与疾病的共有靶点。

1.3 蛋白相互作用(PPI)网络构建将共有靶点输入String数据库(https://string-db.org/)构建PPI网络模型,最小相互作用阈值为“custom value”(>0.40),同时显示设置隐藏游离点,即得到PPI网络;借助Cytoscape 3.8.0软件进行拓扑分析,筛选出重要靶点。

1.4 “药物-活性成分-共有靶点-疾病”网络的构建通过Cytoscape 3.8.0软件构建药物-活性成分-共有靶点-疾病网络图,并使用Network Analysis计算Degree值,筛选关键活性成分。

1.5GO功能与KEGG富集通路分析运用R 4.1.3软件及其相关的“org.Hs.eg.db”“enrichplot”“ggplot2”等安装包对共有靶点进行GO功能与KEGG富集通路分析,设置P<0.05;并对其进行可视化处理。

1.6 分子对接选择拓扑分析结果排名前3位的靶点和Degree值排名前3的活性成分作为核心靶点、关键活性成分,对其进行分子对接验证。通过Pubchem数据库、Chem Bio3D Ultra 14.0软件构建3D结构的关键活性成分;利用PDB数据库下载核心靶点蛋白,利用PyMOL 2.4.0软件和Auto Dock Tools 1.5.6软件对进行常规处理及分子对接。

2 结果

2.1 药物活性成分筛选的结果经Swiss ADME和Swiss Target Prediction数据库筛选后,最终得到19个活性成分(见表1),得到449个有效靶点。

表1 飞龙掌血的有效成分

2.2 疾病靶点和共有靶点的结果DisGeNET数据库1395个靶点、NCBI数据库943个靶点、OMIM数据库173个靶点,合并删除重复值后得到2018个疾病靶点(见图1)。药物活性成分靶点与疾病靶点的共同靶点共有140个(见图2),共有靶点可能是发挥抗肝癌的作用靶点。

图1 疾病韦恩图

图2 药物疾病韦恩图

2.3PPI网络结果共有140个节点,1620条边(见图3)。对其进行拓扑分析并筛选出重要靶点,在重要靶点网络图中其颜色越深,表示Degree值越大,由图可知AKT1、VEGFA、EGFR、CASP3 SRC等可能为飞龙掌血抗肝癌的重要靶点。

图3 PPI网络和重要靶点网络图

2.4 “药物-活性成分-共有靶点-疾病”网络结果

通过Cytoscape 3.7.2软件构建“药物-活性成分-共有靶点-疾病”的网络(见图4)。共包括167个节点,867条边,图中形状越大,代表Degree值越大;图中正方形为药物名称,三角形为疾病名称,菱形为活性成分,圆形为活性成分;根据Degree值的大小,筛选出排名前3的活性的成分作为关键活性成分,即HBIN038476(Oxychelerythrine)、HBIN037045(nitidine)、HBIN023839(Dihydrochelerythrine)。

图4 “药物-活性成分-共有靶点-疾病”网络图

2.5GO功能与KEGG富集通路分析GO功能富集分析中生物过程主要包括对氧化应激的反应、细胞对化学的反应、细胞对氧化应激的反应等;细胞组成主要包括膜筏、染色体区域、膜微区等;分子功能主要包括蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、蛋白丝氨酸激酶活性等;KEGG富集通路主要富集于PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、癌症中的微核糖核酸等信号通路(见图5、图6)。

注:BP为生物过程,CC为细胞组成,MF为分子功能。图5 GO功能富集分析结果

图6 KEGG富集通路

2.6 分子对接结果关键活性成分与核心靶点均具有较好的结合活性,其中AKT1与Oxychelerythrine的结合活性最佳,与Dihydrochelerythrine的结合活性次之(见表2和图7)。

A:AKT1与Oxychelerythrine;B:AKT1与Dihydrochelerythrine;C:AKT1与nitidine;D:EGFR与Oxychelerythrine。图7 部分分子对接图

表2 关键活性成分与核心蛋白靶点的结合能(kJ·mol-1)

3 讨论

肝癌是最常见的致命恶性肿瘤之一,在美国,肝癌是前5种最致命癌症中唯一一种发病率每年增加的癌症。危险因素包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、脂肪肝、酒精相关性肝硬化、吸烟、肥胖、糖尿病、铁超负荷和各种饮食暴露[7]。在所有肝癌病例中,超过90%是HCC,目前,针对肝癌的治疗方法很多,包括原位肝移植、肝切除术、消融技术、介入治疗、放疗、生物治疗和分子靶向治疗等,然而这些疗法有一定的缺点和不良副作用,需要进一步研究以找到治疗肝癌的更好方法[8-9]。天然药物治疗肝癌具有较好的治疗疗效且副作用少。生物碱作为一类源自中药的天然成分,先前已被证明具有突出的抗肝癌作用,通过抑制增殖、转移和血管生成、改变细胞形态、促进细胞凋亡和自噬、触发细胞周期停滞等多种机制,调节各种癌症相关基因以及通路等[10]。因此,生物碱具有抑制肝癌的发展和进展的功效。本研究共筛选出飞龙掌血活性成分19个,成分作用靶点449个,飞龙掌血与肝癌的共同靶点140个;由PPI网络重要靶点图得知AKT1、VEGFA、EGFR、CASP3 SRC等可能为飞龙掌血抗肝癌的重要靶点。

“药物-活性成分-共同靶点-疾病”网络结果显示,氧化白屈菜红碱、二氢白屈菜红碱、氯化两面针碱等可能为治疗肝癌的主要活性成分。朱国福等[11]采用MTT、免疫印迹及荧光定量法研究白屈菜红碱对肝癌的影响,结果表明白氧化白屈菜红碱具有显著的抗肿瘤活性,能通过多种途径发挥抗肿瘤作用;研究表明[12-13]二氢白屈菜红碱能够通过参与多个途径进行诱导细胞周期阻滞和线粒体介导的细胞凋亡,从而达到抑制人肝癌细胞MHCC97-H的增殖,同时具有清热解毒,抗菌消炎的作用;廖艺楠等[14]通过探讨氯化两面针碱(NC)对肝癌Bel-7402细胞系自噬的影响,结果显示氯化两面针碱能激活肝癌Bel-7402细胞自噬,引起Bel-7402细胞自噬性死亡。傅宣皓等[15]主要通过抑制人肝癌细胞Hep G2的增殖,阻滞细胞周期以及通过下调PI3K/Akt/m TOR信号通路中的MMP-2/9的表达,诱导肿瘤细胞凋亡等多种作用机制达到抗肿瘤作用。

KEGG分析结果表明AKT1、VEGFA、EGFR等靶点调控有PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、癌症中的微核糖核酸等信号通路可能是飞龙掌血治疗肝癌的作用通路。分子对接结果表明,关键活性成分与核心靶点均具有较好的结合活性,其中AKT1与Oxychelerythrine的结合活性最佳,与Dihydrochelerythrine的结合活性次之。因此,飞龙掌血中Oxychelerythrine、Dihydrochelerythrine、nitidine、Oxychelerythrine等化学成分可能是通过AKT1、VEGFA、EGFR、CASP3 SRC等靶点,介导PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、癌症中的微核糖核酸等信号通路发挥治疗肝癌的作用。

飞龙掌血可能是多通路、多靶点、多途径来协作治疗肝癌,其作用机制可能与PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、癌症中的微核糖核酸等信号通路有关。但本研究只是在分子层面进行预测,尚未开展动物实验进行验证,仍需进一步完善其机制的理论依据。