小檗碱和大蒜素对香榧绿藻抑制作用研究

黄 杨,郭 明,孙雨婷,王义平,叶碧欢,陈友吾

(1 浙江农林大学林业与生物技术学院,杭州,311300;2 浙江农林大学化学与材料工程学院,杭州,311300;3 浙江农林大学环境与资源学院,杭州,311300;4 浙江省林科院森林保护研究所,杭州,310023)

香榧绿藻(Chlorellasp.)属绿藻门(Chlorophyta)藻类,为小球藻属(Chlorella)的一个变异类型,是一种附着在榧树枝和叶片表面的粗糙灰绿色苔状物[1]。近些年,伴随着香榧种植面积不断扩大,香榧病害发生率也在逐年攀升,现阶段香榧绿藻病害以化学防治为主要,常用石硫合剂作为除藻剂,防治效果较明显,但存在抗药性以及会对环境造成二次污染等问题[2]。为保证榧农收益并贯彻可持续发展的理念,研发设计新型绿色灭藻剂具有重要意义。

有研究表明,植物源物质具有抗癌、抗肿瘤、抗菌、抗疟疾、抗病毒等作用,并且主要以生物碱为主[3-5]。生物碱是指存在于生物体内具有环状结构的含氮碱性有机物,具有见效快、易控制、生态安全性高等特点,近几年利用生物碱对藻类进行抑制的研究也在不断展开[6]。有学者研究发现,粉防己碱、防己诺林碱能够抑制蛋白核小球藻Chlorellapyrenoidosa的生长,当浸提液相对质量浓度1 g/L时抑制蛋白核小球藻的效应最强[7]。有学者评价几种典型植物化感物质对铜绿微囊藻的抑制效果,发现生物碱类化感物质对铜绿微囊藻的抑制效果最为明显,抑制率超过80%;并且4种生物碱中又以小檗碱成本低,效果显著[8]。大蒜素是一种具有刺激气味的含硫有机物,已有文献报道,几种抗生素耐药菌株均被发现对大蒜素敏感[9]。但大蒜素易挥发,是一种酯类物质,难以溶解于藻类溶液中。槐糖脂作为表面活性剂具有生物可降解、无毒害的特点,并且有研究表明,槐糖脂对有害藻类具有较强抑制作用[10-12]。近10年来,利用植物源物质进行藻类防治的报道大多针对引起水体富营养化的铜绿微囊藻Microcystisaeruginosa、斜生栅藻Scenedesmusobliquus等[13-15],主要集中于海岸、河口、湖泊等大生态环境,并取得一定进展[16-19]。对于为害高等植物的树生藻类,如集球藻(Palmellococcussp.)、丝藻(Ulothrixsp.)、小球藻(Chlorellasp.)鲜有报道[1]。因此,针对香榧绿藻(Chlorellasp.),我们选取小檗碱和大蒜素作为抑藻药物,通过测定分析香榧绿藻相关指标变化,为利用小檗碱和大蒜素防治香榧绿藻提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

香榧绿藻(Chlorellasp.)来自浙江农林大学林业与生物技术学院。

试剂与药品:小檗碱,HPLC≥99%,上海超研生物科技有限公司产;大蒜素,分析对照品,二甲基亚砜、BG11培养基、Na2HPO4,上海麦克林生化科技有限公司产;超氧化物歧化酶试剂盒,北京兰杰柯科技有限公司产;过氧化氢酶试剂盒、丙二醛试剂盒,北京源叶生物科技有限公司产。

仪器:显微镜(LEICA DM500)、酶标仪、数显恒温水浴锅,国华电器有限公司产;全自动高压蒸汽灭菌器,上海尧勋智能科技有限公司产;电子分析天平、高速冷冻离心机(Thermo Fisher)、人工气候箱,上海齐欣科学仪器有限公司产;紫外分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司产;样品快速研磨仪,上海净信实业发展有限公司产;超纯水机,四川优普超纯科技有限公司产。

1.2 方法

1.2.1 香榧绿藻培养 在无菌条件下,将藻液接种到经高压灭菌锅灭菌的含有BG-11培养基溶液的锥形瓶中,封口膜封住瓶口,用橡皮筋扎紧,置于3级光照强度的光照培养箱中培养,每天早、中、晚振摇3次,每隔96 h 扩培1次,使藻细胞基本达到同步生长。

1.2.2 小檗碱、大蒜素处理 向二甲基亚砜20 mL中加入小檗碱80 mg配制成小檗碱母液4 mg/mL,再各取小檗碱母液1、2、4、8 mL及二甲基亚砜1 mL(对照)加入至50 mL BG-11培养基中,在加入BG-11培养的处于对数生长期的香榧绿藻溶液,使最终体积为100 mL,小檗碱浓度为40、80、160、320 μg/mL,用封口膜封口,重复3次;测定绿藻细胞的起始浓度,将锥形瓶置于人工气候箱中培养,每4 d取样1次测定香榧绿藻的藻细胞密度、叶绿素a含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性以及丙二醛(MDA)含量。

配制大蒜素母液40、80、160、320 μg/mL,方法同小檗碱配制;用二甲基亚砜400 mL分别配制槐糖脂溶液10、20、40、80 μg/ mL,以大蒜素用量、槐糖脂助剂用量分别为4个水平,培养时间为4、8、12 d等3个水平,采用L16(42×31)混合正交试验,每处理重复3次。

1.2.3 香榧绿藻细胞密度测定 取样前,将锥形瓶振荡摇匀,用胶头滴管吸取距藻液面下1 cm处的藻液1 mL,滴于细胞计数板上,每片计数板进行两次藻细胞数量测定,取平均值,若样本的两次计数结果与其平均数之差不大于其均数的15%,则视为有效数据,否则重新测定。测定完毕后,向锥形瓶中加入BG-11培养液1 mL,维持原有体积[22]。藻细胞密度测定采用血细胞计数法,计算香榧绿藻抑制率。抑制率(%)=(对照藻细胞密度-处理藻细胞密度)/对照藻细胞密度×100。

1.2.4 叶绿素a含量测定 叶绿素提取采用丙酮加热法[20],用移液枪吸取绿藻液2 mL置于离心管中,于10 000 r/min离心5 min,去除上清液,藻饼于80%丙酮2 mL中重悬浮,在黑暗条件下55 ℃水浴60 min后,于10 000 r/min离心5 min,吸出上清液转移至10 mL刻度试管中,并用80%丙酮定容至5 mL,测定663 nm处的光吸收值,计算叶绿素a含量,叶绿素a含量(mg/L)=A663/82。

1.2.5 粗酶液提取及酶活性测定 酶液制备:取藻液2 mL,4 ℃、10 000 r/min离心5 min收集藻细胞,加入预冷的pH值7.8磷酸缓冲液0.05 mol/L 2 mL,在冰浴条件下,用样品快速研磨仪75Hz研磨90 s后,于4 ℃、10 000 r/min离心5 min,所得上清液即为酶液。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑法(NBT)[21]测定,抑制率(%)=(A空白对照1-A样品)/( A空白对照1-A空白对照2) ×100,SOD活性(U)=抑制率/(1-抑制率),式中,1个SOD活性单位为反应体系中抑制百分率达到50%时的酶活性,A空白对照1、A样品、A空白对照2分别为空白对照1、样品和空白对照2的吸光度。

过氧化氢酶(CAT)活性采用钼酸铵微板法,CAT活性(U/mL)=( A自身对照-A测定) /A空白×650,式中,A自身对照、A测定、A空白分别为自身对照、测定管和空白管的吸光度。

1.2.6 丙二醛含量测定 丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定,分解产物MDA常被用作细胞氧化损伤的生物指标[22]。MDA(μmol/L)=6.45×(OD535-OD600)-0.56×OD450。

1.3 数据分析

运用origin 2018软件及SPSS 26.0软件对数据进行图形绘制和统计分析。

2 结果与分析

2.1 小檗碱的作用

2.1.1 对香榧绿藻生长的影响 从表1可以看出,处理4 d时,小檗碱40 μg/mL处理的藻细胞密度与对照无显著性差异,抑制率仅为1.50%;处理12 d时,40 μg/mL处理的抑制率为59.60%。其余小檗碱处理的藻细胞密度随小檗碱浓度升高而下降;处理12 d时,各处理之间均存在显著性差异(p<0.05,下同),此时小檗碱320 μg/mL处理的抑制率为85.45%。说明处理4 d以前,小檗碱40 μg/mL对香榧绿藻的抑制能力较弱;4个浓度处理均随处理时间延长,抑制率增加。

表1 不同质量浓度小檗碱处理对香榧绿藻的抑制作用

2.1.2 对香榧绿藻叶绿素a和丙二醛含量的影响 从图1可以看出,叶绿素a含量变化趋势与藻细胞密度变化趋势基本一致。处理4 d 时,小檗碱40 μg/mL处理与对照之间无显著性差异;处理8 d时,小檗碱各处理叶绿素a含量均显著低于对照。处理4 d 时,80 μg/mL与160 μg/mL处理间存在显著性差异;处理12 d时,两组之间无显著性差异。

图1 不同质量浓度小檗碱处理对香榧绿藻叶绿素a和丙二醛含量的影响

试验期间,对照的丙二醛含量保持在正常水平,除了处理4 d时40 μg/mL,其他时间其余小檗碱处理的丙二醛含量均比对照显著增加;40 μg/mL和80 μg/mL处理的丙二醛含量在各时间段差异均不显著。160 μg/mL与320 μg/mL在处理4 d 和8 d 差异不显著,处理12 d这两个处理间差异显著。

2.1.3 对香榧绿藻酶活性的影响 从图2可以看出,处理4 d 时,小檗碱40 μg/mL和80 μg/mL处理的SOD活性均显著高于对照,160、320 μg/mL处理的SOD活性与对照无显著性差异。处理8 d 时,小檗碱40 μg/mL处理的SOD活性仍显著高于对照,80、160 μg/mL处理的SOD活性低于对照,但差异不显著;320 μg/mL处理SOD活性显著低于对照。处理12 d时,小檗碱处理的SOD活性均显著低于对照,且各处理间存在显著性差异。说明小檗碱对香榧绿藻SOD活性存在低促高抑现象。

图2 不同质量浓度小檗碱处理对香榧绿藻超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性的影响

CAT活性与SOD变化趋势一致,处理4 d时,40、80 μg/mL处理CAT活性显著高于对照,前两者间差异不显著;160、320 μg/mL处理与对照间差异不显著。处理8 d 时,40、80 μg/mL处理与对照间无显著性差异,160、320 μg/mL处理显著低于对照160 μg/mL与320 μg/mL处理间无显著性差异。处理12 d时,小檗碱处理CAT活性均低于对照,160 μg/mL与320 μg/mL处理间、40 μg/mL与80 μg/mL处理间差异不显著。说明高浓度(160、320 μg/mL)小檗碱从开始就能够通过降低酶活性来抑制藻细胞生长。

2.2 大蒜素的作用

从表2和图3可以看出,A4B2C3,即大蒜素320 μg/mL+槐糖脂助剂20 μg/mL+培养12 d处理效果最好,抑制率为85.50%,略高于小檗碱。A4B2C3处理与对照之间差异明显,可从培养平板直观看出对照藻细胞数量逐渐增多,大蒜素处理的藻细胞数量逐渐减少。为进一步验证3个因素交互效应所产生的误差是否会影响结果的准确性,对表2中A、B、C 3个因素进行方差分析可得各因素主体间效应,并进行方差分析,得出的误差、自由度、均方计算出交互效应的显著性为0.130 2>0.05,因此3个因素之间的交互效应不显著,此时可以忽略交互效应所带来的误差,表明表2数据真实可靠。

图3 不同培养时间大蒜素320 μg/mL+槐糖脂助剂20 μg/mL处理对香榧绿藻的抑制作用

表2 大蒜素、槐糖脂、培养时间L16(42×31)混合正交试验对香榧绿藻的抑制作用

经过试验组数与藻细胞密度间的效应检验,大蒜素浓度与处理时间对香榧绿藻细胞的作用存在显著影响,而助剂浓度的影响并不显著,推测可能由于槐糖脂对绿藻液无直接抑制作用,而是使大蒜素更均匀地分散在藻液中,从而提高抑制率。说明大蒜素添加合适的生物助剂能够获得良好的抑藻效果。推算的最佳方案为A4B2C3,与表2中实际测定结果一致。

3 讨论

小檗碱作为公认的抑制藻类生长的生物碱,已被广泛应用于抑藻研究,但其抑制树生藻类的研究鲜有报道。本研究探讨了其对香榧绿藻生长的抑制情况,结果表明,不同浓度小檗碱对香榧绿藻的抑制作用不同。处理4 d时,低浓度(40、80 μg/mL)处理的SOD和CAT活性均达到顶峰并显著高于对照,推测其原因可能是低浓度的小檗碱在前4 d时促使香榧绿藻细胞产生的活性氧并未超出其细胞的承受范围,因此在绿藻细胞内形成了短期的负反馈调节,使得SOD、CAT活性升高。有研究表明,藻细胞面对低浓度生物碱进攻时会形成较好的抵御机制,通过提高酶活性来清除短时间内因环境胁迫而产生的自由基[23-24],这与本试验结果一致。不同于活性氧(ROS)系统,低浓度小檗碱仍然可以降低香榧绿藻叶绿素a含量从而影响藻细胞光合作用,致使细胞死亡。刘彦彦探究了白屈菜红碱对铜绿微囊藻光合系统的影响,认为白屈菜红碱能够攻击微囊藻光合系统反应中心供体,影响电子传递从而致使叶绿素a含量下降,光合作用系统受损[25]。处理8 d后,藻细胞内的活性氧含量逐渐增多,超出了抗氧化系统的承受能力,从而导致SOD、CAT活性下降,丙二醛含量逐渐增多,细胞膜脂质过氧化,叶绿素a含量下降,光合系统无法正常进行,最后藻细胞凋亡。高浓度小檗碱致使香榧绿藻细胞内的叶绿素a含量急速下降,无法正常进行光合作用,活性氧浓度不断升高,超过其耐受范围,ROS清除系统无法正常运行,形成正反馈调节,SOD、CAT活性持续下降,活性氧浓度进一步升高,丙二醛含量也逐步升高,细胞膜脂质过氧化加剧,最终导致细胞新陈代谢机制受损,细胞死亡。尽管室内试验结果显示小檗碱对香榧绿藻的抑制效果十分明显,但还缺少林间应用试验,林间防治时需考虑药剂漂移,气候因素等条件对药效的影响,有待进一步研究。

大蒜素作为一种高效的抗菌药物被广泛应用于各个领域,被誉为天然抗生素[26-27]。大量研究表明,其抑菌机制主要为还原型谷胱甘肽(γ-L-Glutamyl-L-cysteinylglycine,GSH)作用于含有二硫键的大蒜素,使二硫键断裂,自身被氧化成氧化型谷胱甘肽(L-Glutathione Oxidized,GSSG),而GSH被认为是许多生物体细胞质中含量高达10 mmol/L的主要抗氧化物质,是保护细胞抵御氧化应激的第一道防线[28-29]。Sharifi-Rad等研究表明,银纳米粒子和大蒜素的联合作用可有效用于治疗耐药性微生物菌株引起的皮肤感染[30]。Strehlow等开发出一种用于治疗肺部疾病的微粒制剂,将大蒜素封装于由乳糖形成的微球中[31]。尽管大蒜素具有广阔的应用前景,但仍需要克服其易挥发的特点,以及存在化感效应,大蒜素或有可能在林间使用时对香榧生长造成影响,需进一步研究验证[32-33];后续将围绕降低大蒜素的挥发性以及提高其对香榧绿藻的靶向性开展试验。有研究表明,藻类生长过程中会使自身环境pH值上升呈碱性[34-35],对此可以设计响应pH值变化以及将二硫键接到缓释载体上并包覆大蒜素,在克服大蒜素挥发性的同时提高其对香榧绿藻的靶向性。

本研究结果表明,小檗碱能够影响藻细胞光合作用造成其抗氧化系统失衡,过多活性氧积累超出细胞耐受范围,干扰细胞代谢,致使细胞膜过脂化,细胞结构严重受损,从而抑制香榧绿藻的生长;大蒜素有望制备成一种新型的杀藻剂,需进一步开展其与香榧绿藻互作机制以及改良其性能的相关研究。