HMGB1与HMBOX1的高表达在结直肠癌患者预后评估中的作用

王宝良,陈铁良,吴家剑,董智刚,杨立群

(唐山市协和医院,1.病理科;2.普通外科;3.麻醉科;4.华北理工大学附属医院普通外科;5.唐山市丰南区医院普通外科,河北 唐山 063000)

结直肠癌是源于大肠腺上皮的恶性肿瘤,可发生在各段大肠,是常见的恶性肿瘤之一。相关数据显示,中国的结直肠癌发病率处于较高水平,在所有的癌症中发病率位居第五[1]。目前对于结直肠癌,手术切除病灶并以放疗、化疗作为辅助治疗是最主要的治疗方式。结直肠癌的发生主要是由于物理、化学、病毒等因素导致的致癌、致畸变,在该过程中同时涉及原癌基因的激活及抑癌基因的失活[2]。高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1,HMGB1)是比较有代表性的肿瘤相关基因,与细胞增生、分化、迁移有关[3]。相关研究[4]表明,结直肠癌患者癌组织中HMGB1的高表达可使患者病灶内免疫淋巴细胞浸润更为明显,且患者的生存时间相对缩短。核转录因子1(homeobox-containing 1,HMBOX1)是一种新型转录抑制因子,可参与DNA损伤修复,在机体多种正常组织中均有表达,可控制细胞的增殖、凋亡、转移及自我更新[5]。本研究欲采用免疫组化方法检测结直肠癌患者癌组织及远端结直肠组织HMGB1与HMBOX1的表达情况,探讨HMGB1与HMBOX1的高表达在结直肠癌患者预后评估中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年1月至2016年11月唐山市协和医院收治的96例结直肠癌切除术患者作为研究对象。其中男性49例,女性47例;年龄(71.50±3.67)岁;原发位置为右半结肠者25例,左半结肠者32例,直肠39例;TNM分期I～II期60例,III～IV期36例;T1～T2者52例,T3～T4者44例;N0～N1者80例,N2者16例;高分化和中分化59例,低分化37例。纳入标准:(1)患者组织病理活检确诊为结直肠癌;所有病理切片均由本院两名病理医师复核证实;(2)临床治疗遵守NCCN指南原则[6];(3)患者肿瘤均无远处转移;(4)患者临床及随访资料完整。排除标准:(1)患者术前接受放疗或化疗;(2)由于除肿瘤复发或转移以外的原因死亡。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 免疫组化

1.2.1 检测仪器及试剂 脱水机(赛默飞)、包埋机(徕卡)、手动轮转式石蜡切片机(徕卡)、展片机(爱华)、烤片机(爱华)、生物显微镜(奥林巴斯)。HMGB1兔多克隆抗体(上海碧云天),HMBOX1兔多克隆抗体(上海酶联),辣根过氧化物酶标记山羊抗人IgG(H+L)(上海碧云天)。

1.2.2 检测方法 采集患者适量正常结直肠组织与结直肠癌组织,经固定、洗涤、脱水、包埋后制作石蜡切片,切片厚度为4 μm。然后行免疫组织化学染色:将石蜡切片依次经二甲苯与梯度酒精中脱蜡至水,蒸馏水冲洗后,加入3% H2O2浸泡10 min,除去内源性的过氧化氢酶;弃H2O2后使用蒸馏水中洗两次,再加入14%柠檬酸缓冲液,加热暴露抗原位点;冷却至室温,蒸馏水洗,PBS浸泡5 min×2次;加入5%正常山羊血清(PBS 稀释)封闭,室温孵育 10 min;滴加一抗(HMGB1:1∶200;HMBOX1∶1∶200),4 ℃冰箱中保存过夜;PBS冲洗5 min×3次,擦干组织周围的PBS后滴加二抗,然后置于37 ℃温箱中30 min;滴加辣根过氧化物酶标记山羊抗人IgG(H+L)(1∶1 000)37 ℃ 孵育 30 min;PBS冲洗3次,每次5min,擦干组织周围的PBS后加DAB显色剂显色15 min;将显色后的片子用清水冲洗并浸泡于苏木精中10 min,复染后脱水、透明、中性树脂封片,每张切片选取10个200×镜下视野,由我院两名专业的病理医师镜检判断HMGB1与HMBOX1表达状况。

1.2.3 结果评分及分组 (1)评估 HMGB1染色:阳性细胞数占细胞总数的百分比评分:0%～5%为0分,6%～25%为1分,26%～50%为2分,51%～75%为3分,76%～100%为4分;染色强度评分:细胞无着色=0分,呈淡黄色=1分,呈黄色=2分,呈棕黄色=3分。最终免疫评分=平均阳性细胞率+细胞着色强弱得分,0～4分纳入HMGB1 低表达组,5～7分纳入HMGB1 高表达组[7]。(2)评估 HMBOX1染色:阳性细胞数占细胞总数的百分比评分:0%为0分,1%～10%为1分,11%～50%为2分,51%～100%为3分。染色强度评分:细胞无着色=0分,呈淡黄色=1分,呈黄色=2分,呈棕黄色=3分。最终免疫评分=染色百分比评分×染色强度评分,0～4分纳入HMBOX1低表达组;6～9分纳入 HMBOX1高表达组[6]。

1.3 临床资料收集及随访

收集所选取的96例结直肠癌患者的性别、年龄等一般临床资料,采用 TNM分期(第8版)[8]对术后所得的病理组织切片进行评估确定各患者肿瘤TNM 分期及分级。在患者术后出院,采取门诊或电话方式对患者病情进行持续跟踪,随访频次为3～6个月/次,随访时间为5年。

1.4 统计学分析

使用SPSS 22.0软件进行数据分析。计数资料采用 [n(%)]表示,组间比较采用独立样本χ2检验;采用交叉列联表分析结直肠癌组织中HMGB1与HMBOX1表达的相关性;生存时间采用Kaplan-Meier生存曲线和Log-rank法比较两组患者的生存率;Cox回归综合生存分析影响患者预后的危险因素,分析结直肠癌患者预后差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织中HMGB1与HMBOX1的表达情况

免疫组化结果显示,HMGB1与HMBOX1在细胞核与细胞质中均有表达,在个别正常的结直肠组织中弱表达,但在结直肠癌组织中表达量升高,免疫组化染色呈阳性。依据免疫组化结果将96例结直肠癌患者分为蛋白高表达组与低表达组,其中HMGB1高表达组60例、低表达组36例;HMBOX1高表达组55例、低表达组41例。见图1。

2.2 结直肠癌组织中HMGB1与HMBOX1表达与临床病理特征的关系

结直肠癌患者中低分化程度者HMGB1高表达率较高(P<0.05),不同性别、年龄、原发位置、TNM分期、T分类、N分类等患者HMGB1高表达率比较,差异均无统计学意义(P>0.05);HMBOX1高表达与患者年龄、结直肠癌TNM分期及分化程度有关,其中年龄越低、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ及分化程度为低分化者HMBOX1高表达率较高(P<0.05),不同性别、原发位置、T分类、N分类、M分类HMBOX1高表达率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3 结直肠癌组织中HMGB1与HMBOX1表达的相关性

采用交叉表分析结直肠癌组织中HMGB1与HMBOX1表达的相关性。结果显示,结直肠癌组织中HMGB1与HMBOX1均高表达占73.33%,HMGB1与HMBOX1均低表达的占69.44%,(r=0.419,P<0.05),因此,结直肠癌组织中HMGB1与HMBOX1表达相关。见表2。

表1 结直肠癌组织中HMGB1与HMBOX1表达与临床病理特征的关系 [n(%)]

表2 结直肠癌组织中HMGB1与HMBOX1表达的相关性[n(%)]

2.4 结直肠癌组织中HMGB1与HMBOX1表达与患者预后间的关系

生存分析结果显示,HMGB1高表达组第3、5年的总生存率分别为:56.7%、33.3%,HMGB1低表达组第3、5年的总生存率分别为:80.6%、55.6%;HMGB1高表达组第3、5 年的无瘤生存率分别为:36.7%、33.3%,HMGB1低表达组第3、5年的无瘤生存率分别为:61.1%、55.6%,均高于HMGB1高表达组(χ2=5.415,4.571,P<0.05);HMBOX1高表达组第3、5年的总生存率分别为:50.9%、27.3%,HMBOX1低表达组第3、5年的总生存率分别为:85.4%、61.0%,均高于HMBOX1高表达组(χ2=12.363,10.978,P<0.05);HMBOX1高表达组第3、5年的无瘤生存率分别为:28.1%、27.3%,HMBOX1低表达组第3、5年的无瘤生存率分别为:68.3%、60.4%,均高于HMBOX1高表达组(χ2=14.540,10.978,P<0.05)。见图2。

2.5 结直肠癌患者总生存时间的危险因素分析

单因素分析结果显示,TNM分期为Ⅲ～Ⅳ、T分级为T3～T4、N分级为N2、HMGB1高表达与HMBOX1高表达均为结直肠癌患者总生存时间的影响因素(P<0.05);多因素分析结果显示,T分级为T3～T4、N分级为N2与HMBOX1高表达为结直肠癌患者总生存时间的独立预测因子(P<0.05)。见表3。

表3 单因素和多因素Cox 回归综合生存分析

3 讨论

现代肿瘤学认为[9],结直肠癌的发病主要与患者的年龄、生活方式、环境、饮食结构、遗传因素等相关。在多种因素的相互作用下,原发灶部位细胞由于原癌基因的激活、抑癌基因的抑制、DNA甲基化及错配修复等机制发生癌变[10],在该癌变过程中,多种关键因子表达异常,参与调控癌细胞的增殖与迁移。本研究通过免疫组化法检测各患者结直肠癌组织及远端结直肠组织HMGB1与HMBOX1的表达,分析结直肠癌患者预后差异,为临床结直肠癌的治疗与预后评估提供一定的理论基础。

HMGB1是一组非组蛋白,可参与肿瘤的形成与机体的炎性反应、细胞增殖、分化及迁移等。低表达HMGB1可有效促进结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力以及上皮-间质化,具有作为临床结直肠癌治疗的潜在靶点和指标。相关研究[11]表明,结直肠癌患者癌组织中HMGB1的表达与结直肠癌组织学分化程度、浸润深度、淋巴结转移明显相关,且HMGB1阳性表达患者的生存时间相对缩短。本研究结果显示,HMGB1在结直肠癌组织中的表达水平较正常的结直肠组织升高,且HMGB1高表达与患者结直肠癌分化程度相关(P<0.05),HMGB1高表达组第3、5年的总生存率及无瘤生存率均低于HMGB1低表达组,与已有研究[11]结果相符。其机制可能为HMGB1高表达能够一定程度影响GSK3β的活化,使GSK3β下游靶基因c-Myc靶向调节E-钙粘蛋白,促进肿瘤细胞的迁徙和转移[12],加速肿瘤进展,最终导致患者生存率降低。

HMBOX1可参与DNA损伤修复,是该过程中的关键转录抑制因子,可表达于机体多种正常组织中,但具有不同的表达模式和异质性,同时在胃癌组织[13]、肝癌组织、卵巢癌中均有表达。相关研究[14]表明,HMBOX1的表达水平与肝癌临床TNM分期呈负相关。HMBOX1可增加内源性自噬标志物 LC3 II/LC3 I比率,抑制p38/AKT/mTOR通路。此外,HMBOX1过表达还可抑制癌症干细胞CD133、KLF4、ESG1和SOX2等特异性基因,使其表达下调。同样有研究[15]表明,HMBOX1在卵巢癌组织和卵巢癌细胞系中的下调,可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。有效下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,上调促凋亡调节蛋白Bad、Bax的表达和凋亡执行者Caspase-3及P53的表达。本研究显示,HMBOX1在结直肠癌组织中的表达水平较正常的结直肠组织升高(P<0.05),HMBOX1高表达与年龄、患者结直肠癌TNM分期及分化程度相关(P<0.05)。HMBOX1高表达组第3、5年的总生存率及无瘤生存率低于HMBOX1低表达组,与已有研究[16]结果相符。同时本研究分析发现结直肠癌组织中HMGB1与HMBOX1高表达相关(P<0.05)。且Cox回归分析结果显示,HMBOX1高表达为结直肠癌患者总生存时间的独立预测因子。推测HMBOX1高表达可能促进癌细胞增殖,抑制癌细胞的凋亡,促进病灶生长,最终加速肿瘤的复发与生存时间的缩短。

综上,HMGB1高表达与患者结直肠癌分化程度相关,HMBOX1高表达与患者年龄、结直肠癌TNM分期及分化程度相关,且HMGB1与HMBOX1的高表达具有相关性,其高表达时患者生存时间减少,可作为患者术后预后评估的重要指标。但本研究中所选取的样本量较少,对于HMGB1与HMBOX1表达的相关性、与结直肠癌患者临床病理特征的相关性及对结直肠癌患者总生存时间的危险因素分析均缺乏较强的说服力,且免疫组化检测HMGB1与HMBOX1表达量不够准确,之后将扩大样本量及运用酶联免疫吸附或蛋白免疫印迹等更为准确的蛋白检测方法进行优化,以此研究为基础做更加深入的研究。