三阴性乳腺癌中MIF与D-DT的表达及其临床意义

吴燕,陈硕,龙琼先,文彬,黄一凡

(1.川北医学院第二临床医学院·南充市中心医院病理科;2.南充市中医医院骨科;3.川北医学院病理学教研室,四川 南充 637000)

乳腺癌(carcinoma of breast,CA)是导致全球女性死亡的最常见癌症之一,在全球绝大多数国家中,居女性癌症发病和死亡之首。在中国,女性恶性肿瘤中乳腺癌的发病率和死亡率分别位于第一位和第五位[1-2],乳腺癌的发病率逐年递增,且发病年龄趋于年轻化。三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)指雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER2)在免疫组织化学中均为阴性的乳腺癌,大约有80%与固有的“基底样”亚型重叠,占所有乳腺癌的15%～20%。与其他亚型相比,TNBC组织学分级高、侵袭性强、复发转移率高,预后差,目前尚缺乏标准有效的治疗[3-4]。因此,为TNBC寻找新的生物标志物及治疗上的新思路、新靶点,是目前临床科研亟待解决的问题。巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)与许多癌症表型的肿瘤发生、血管生成和转移有关,在多种恶性肿瘤中高表达[5]。D-多巴色素互变异构酶(D-dopachrome tautomerase,D-DT)是人类基因组中唯一已知的MIF同源物,两者具有重叠的生物活性谱,在控制细胞存活、肿瘤形成、细胞迁移等方面表现出显著的功能重叠和协同作用,是缺氧诱导因子的直接转录靶点,是瘤内低氧的标志[6]。目前,国内外对 D-DT和MIF在恶性肿瘤中联合检测的研究相对较少,两者在TNBC中的联合检测尚未见报道。本研究通过免疫组化法检测MIF、D-DT在三阴性乳腺癌中的表达情况,并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

根据纳入标准收集2010年1月至2014年12月川北医学院附属医院收治的99例TNBC患者的存档石蜡组织块及临床资料,同时随机选取同期乳腺瘤组织20例、TNBC相应癌旁组织99例作为对照。纳入标准:(1)行根治手术的原发乳腺癌女性患者,有完整的临床病理资料;(2)术前未行放化疗,未出现远处转移,术后接受规范化的辅助治疗;(3)未合并其他部位肿瘤及全身性系统疾病。TNBC组患者平均年龄(49.83±10.77)岁;病理类型:浸润性导管癌97例,其他病理类型两例(浸润性小叶癌1例,腺样囊性癌1例);97例浸润性导管癌参照Scarff-Bloom-Richardson(ESBR)分级系统[7]进行组织学分级:Ⅰ级2例,Ⅱ级64例,Ⅲ级31例;肿瘤大小(最大直径d):≦2 cm者19例,2 cm﹤d≦5 cm者69例,﹥5 cm者11例;有淋巴结转移者50例,无淋巴结转移者49例;TNM分期[参照乳腺癌TNM分期(AJCC)第六版[8]]:Ⅰ期11例,Ⅱ期66例,Ⅲ期22例;Ki-67指数:低表达者11例,高表达者88例。

1.2 方法

鼠抗人MIF单克隆抗体购自台湾Abnova公司(稀释浓度1∶50),鼠抗人D-DT单克隆抗体购自ORIGENE公司(稀释浓度1∶150)。所有标本均为10%中性福尔马林固定,所有蜡块均连续切片,每张切片厚度3 μm。免疫组化采用SP法。

免疫组化结果判读标准:MIF、D-DT蛋白以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性表达。免疫组化评分方法:根据染色强度(不着色0分,淡黄色1分,黄色2分,棕黄或黄褐色3分)和阳性染色范围(以阳性染色细胞所占百分比划分,<5%为0分,5%～25%为1分,>25%～50%为2分,>50%为3分)评分,结果将两者分数相乘,0～1分为阴性(-),2～3分为弱阳性(+),4～6分为中度阳性(++),7～9分为强阳性(+++)。结果均由两位资深病理医师进行独立评分,取两者平均分。

根据住院病历所留的联系方式,以电话对患者或其家属进行随访,随访时间从手术之日起至2019年10月31日或患者死亡。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行数据分析。计数资料以[n(%)]表示,组间比较采用χ2检验。相关性分析采用Spearman等级相关分析。生存资料分析采用Kaplan-Meier生存分析及Log-rank检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MIF、D-DT在TNBC、癌旁组织及纤维腺瘤中的表达情况

MIF、D-DT在TNBC中的阳性表达率均高于癌旁组织和纤维腺瘤,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1及图1。

表1 MIF、D-DT在TNBC、癌旁组织及纤维腺瘤中的表达情况[n(%)]

2.2 MIF、D-DT的表达与TNBC临床病理特征之间的关系

MIF在TNBC中的表达与年龄有关(P<0.05),D-DT的表达与组织学分级有关(P<0.05)。见表2。

表2 MIF、D-DT在TNBC中的表达与临床病理参数的关系

2.3 MIF、D-DT在TNBC中表达的相关性分析

Spearman等级相关分析结果显示,MIF与D-DT在TNBC中的表达呈正相关(r=0.254,P=0.011)。见表3。

表3 TNBC组织中MIF、D-DT蛋白表达之间的关系

2.4 MIF、D-DT的表达及临床病理特征与TNBC患者生存率的关系

自术后起截至随访日期(2019年10月31日或患者死亡),获访具有完整信息病例47例,13例死亡,总生存率为72.3%。对获访资料的临床病理特征、MIF、D-DT采用Log-rank检验方法进行单因素分析,显示淋巴结转移情况、MIF、D-DT表达情况与患者生存率具有相关性(P<0.05)。见图2-图4及表4。

表4 MIF、D-DT及淋巴结转移情况与术后随访资料

3 讨论

乳腺癌是绝大多数国家最常见的癌症[1],目前应用最广泛的诊治手段和策略是根据乳腺癌肿瘤病理学上不同的分子分型制定不同的治疗方案[9],TNBC目前尚缺乏标准有效治疗,因此,为其寻找新的生物学标记及治疗靶点,制定个体化治疗方案,具有重要的临床意义。

MIF是一种多功能促炎蛋白,是抗癌治疗的靶点。多项研究[6,10-12]表明MIF可通过肿瘤抑制因子下调、诱导 MAPK/ERK 和 PI3K/AKT等途径的活化从而在肿瘤的发生发展中起关键作用,且在多种恶性肿瘤中高表达,与不良预后相关。田玉伟等[13]发现胆管癌组织中MIF阳性表达率显著高于癌旁组织,MIF高表达与患者病情严重程度、复发和生存明显相关。有文献[14]表明MIF在胆囊癌组织中高表达,促进胆囊癌细胞迁移和侵袭,且与患者不良预后有关。Balogh等[15]实验结果显示MIF在乳腺癌模型MMTV pMYT和4T1中通过抑制抗肿瘤免疫反应,促进肿瘤的进展。Guo等[16]发现MIF在胰腺导管腺癌的发生发展中具有诊断和治疗的双重作用。本研究结果显示,TNBC患者MIF阳性表达者总生存率及平均生存时间明显低于阴性表达者,Kaplan-Meier生存曲线显示MIF的表达与患者预后相关(P<0.05),提示MIF阳性患者预后差,阻断MIF可提高患者生存率、延长生存期,这与既往的报道一致。以上结果提示MIF可作为判断TNBC预后的重要标记物和分子治疗的靶点。

D-DT在癌症进展中的作用与MIF相似,众多实验结果表明D-DT在多种恶性肿瘤中高表达,参与肿瘤的发生发展,与肿瘤的不良预后相关。Kobold等[17]的研究结果显示D-DT在B16F10黑色素瘤和4T1乳腺癌模型中高表达,靶向D-DT可以减缓该模型的肿瘤进展。Guo等[16]的实验研究表明D-DT在胰腺导管癌组织和细胞系中过表达,D-DT的敲除可减弱PANC-1细胞的增殖、侵袭。Wang等[18]发现D- DT在宫颈癌组织中过度表达,体内外实验显示D-DT的敲除能抑制宫颈癌细胞的侵袭、迁移和移植瘤的生长。Cavalli等[10]发现D-DT的高表达与神经母细胞瘤较差的预后相关,抑制D-DT能够在体外逆转长春新碱的敏感性,导致较好的总生存期。本研究结果显示,TNBC中D-DT阳性表达患者总生存率和平均生存时间明显低于阴性表达者,Kaplan-Meier生存曲线显示D-DT的表达与患者生存率和生存期相关(P<0.05),提示D-DT阳性患者预后差,抑制D-DT可显著改善患者预后。这与Cavalli等[10]的报道一致。以上结果提示D-DT是一种不良预测因子,可作为判断TNBC预后的指标和分子治疗的新靶点。

有研究[19]发现淋巴结转移是影响乳腺癌和三阴性乳腺癌患者预后的独立因素。本研究结果显示有淋巴结转移者的生存率显著低于无淋巴结转移者,淋巴结转移是影响TNBC预后的显著因素(P<0.05),与上述报道一致。

肿瘤的发生发展是多因素、多步骤、多基因相互作用的结果。相关研究[6,16,18]提示,MIF和D-DT在多种癌症中的表达呈正相关,共同导致不良预后,本实验Spearman等级相关分析结果显示,MIF与D-DT在TNBC中的表达呈正相关(r=0.254,P=0.011),与既往报道一致。目前抗MIF策略成为了一个活跃的研究领域,已经开发了许多在癌症研究中抑制MIF生物学功能的方法,包括用小分子MIF抑制剂破坏MIF的活性、MIF的间接失稳和抗MIF抗体等,其中应用最广泛的是竞争性抑制剂(如Iso-1、Iso-66等)和不可逆抑制剂(如4-IPP),这些方法的应用在多种癌细胞系和癌症模型中均显示可导致肿瘤生长、血管形成和细胞增殖的减少[5]。例如人抗MIF单克隆抗体Imalumab适用于转移性结肠癌、多发性骨髓瘤的治疗,已经完成了二期临床试验[20],Iso-66已被证实可延缓结直肠癌的进展[21]。但这些靶向药物仍存在一些不足,如活性低、效力低等, 而针对MIF/D-DT双靶点的抑制剂4-IPP则能取得更好的靶向效果,这表明当前抗MIF的治疗效果可能通过两者的联合靶向而得到加强。

综上,MIF、D-DT及淋巴结转移是影响TNBC患者预后的危险因素。联合检测MIF、D-DT可能为TNBC患者的预后判断及个体化治疗提供新指标、新思路。