基于网络药理学和分子对接技术研究四物汤配伍黄芪提高免疫力的作用机制

杨艳,刘丹,邓春海,王雨辰,韩峰

(承德市市场监督管理综合执法局,河北 承德 067000)

四物汤是常用于补血的传统方剂,由当归、川芎、白芍、熟地黄四味中药组成。首载于唐代骨伤科大家蔺道人的《仙授理伤续断秘方》,具有补血活血,调经化瘀之功;主治冲任亏虚,月经不调,崩中漏下,血瘕块硬,胎动不安,腹痛血下等中医学领域的病症。传统中医认为“气为血之帅,血为气之母”,气与血在中医学理论中有着密不可分的关联。因此,黄芪作为补气要药,非常适合与四物汤配伍联合使用。“卫气”“营血”等中医概念与现代医学有的“营养”“免疫”等概念有一定重合。现代药理学[1-3]表明,当归、熟地黄、黄芪中所含的多糖成分可有效提高机体免疫力。因此,使用四物汤配伍黄芪(SWT-H)提高机体免疫力具有一定的理论基础和潜在可行性。本研究通过网络药理学和分子对接技术,寻找SWT-H中与免疫功能相关的有效成分,挖掘其潜在的分子机制。

1 材料与方法

1.1 方法

1.1.1 SWT-H的有效成分筛选 使用TCMSP数据库,通过对SWT-H中五味中药所含的有效成分进行搜索,按照OB>30%、DL值>0.18的标准进行筛选。排除重复成分、以及数据库中明显出现错误的成分。同时,采用文献检索的方法,在CNKI、PubMed等文献数据库上检索五味中药的相关报道,以补充因数据库本身不足而带来的有效成分缺失。

1.1.2 SWT-H的有效成分作用靶点以及提高人体免疫力相关靶点预测 使用PharmMapper数据库,对所得成分所作用的靶点进行预测分析[4]。将得到的靶点蛋白带入Uniprot数据库进行名称标准化,得到成分所作用靶点的基因名称。使用GeneCards数据库,对肾脏缺血再灌注损伤后纤维化对应的提高人体免疫力靶点进行搜索,确定搜索关键词为Renal ischemia-reperfusion injury和Renal fibrosis。分别取各自结果的前500种靶点。并对检索结果进行整理、合并、去除重复项。上述成分所作用的靶点与提高人体免疫力对应的靶点带入Jvenn平台进行韦恩分析,并绘出二者重复情况的图片。二者重合部分即为SWT-H提高人体免疫力的潜在核心靶点。

1.1.3 PPI网络与中药-成分-靶点-功能网络构建 将上述潜在核心靶点带入String数据库,进行蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)分析,并构建出PPI网络作用图。同时,根据上述分析所得中药、有效成分、作用靶点、功能靶点的关系,使用Cytoscape 软件,构建出中药-成分-靶点-功能网络图。

1.1.4 基因富集分析 将核心靶点带入Metascape在线平台进行GO分析:包括通路和生物学过程富集分析、细胞功能类型分析,并对富集分析的结果进行可视化处理。

1.2 分子对接

采用分子对接技术,对上述网络药理学分析进行进一步验证。利用PDB数据库(http:// www.rcsb.org/)下载 PPI 网络的核心蛋白质结构,利用PubChem(https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov /)数据库下载核心有效成分的sdf文件,将其利用 OpenBabel 软件转化为 mol2 格式,最后将得到的蛋白结构(受体)及有效成分(配体)运用 autodock 软件进行分子对接,最后使用Discovery Studio和 Pymol 软件将分子对接的结果可视化。

2 结果

2.1 网络药理学分析结果

2.1.1 SWT-H有效成分筛选结果 通过TCMSP平台搜索、文献查阅的方法,最终得到SWT-H所含有效成分93种,其中,当归32种、熟地黄17种、川芎8种、白芍12种、黄芪30种,重复成分6种。

2.1.2 SWT-H有效成分作用靶点以及提高人体免疫力相关靶点预测结果 使用PharmMapper对SWT-H的有效成分进行靶点预测,每种成分所作用的靶点取前30种,除去重复项,得到211种SWT-H有效成分所作用的靶点。GeneCards数据库搜索与人体提高免疫力相关的靶点,搜索关键词为Develop immunity from disease,共取500种相关靶点。Jvenn平台进行韦恩分析并作图,得到重复靶点29种。该29种靶点即为SWT-H提高人体免疫力的潜在核心靶点。见表1及图1。

表1 SWT-H提高人体免疫力的核心靶点汇总

2.1.3 PPI网络与中药-成分-靶点-功能网络构建结果 将29种核心靶点代入String平台进行PPI分析,并做出PPI网络图。得到如下结果:节点数为29、边数为149、平均节点度为10.3。其中节点表示蛋白靶点、节点度表示每个几点连接的边数。在29种核心靶点中,节点度大于平均节点度的共有13种,提示该13种靶点在SWT-H发挥增强免疫力的过程中扮演更加重要的角色。运用Cytoscape软件构建出SWT-H提高人体免疫力的中药-成分-靶点-功能网络图。根据结果显示,洋川芎内酯 A(Senkyunolide A)、洋川芎内酯 I(Senkyunolide I)、芍药苷(Paeoniflorin)、3,3′Z-6.7′,7.6′-双藁苯内酯(3,3′Z-6.7′,7.6′-diligustilide)等成分,可能是SWT-H提高人体免疫力的核心成分。见图2及图3。

2.1.4 基因富集分析结果 (1)通路和生物学过程富集分析结果:通过Metascape平台对29种核心靶点进行GO通路和生物学过程分析[5]。根据相关性降序排列,选取前20种条目。做出柱形图和网络图对结果进行数据可视化。其中,癌症相关通路(hsa05200:Pathways in cancer)、止血过程(R-HSA-109582:Hemostasis)、伤口愈合(GO∶0042060:wound healing)、炎症、COX-2和EGFR的关系(Relationship between inflammation)等条目与增强人体免疫力高度相关。见图4。(2)细胞功能富集分析结果 通过Metascape平台对29种核心靶点进行细胞功能富集分析,得到如下条目:肝脏HEPG2细胞(PGB∶00002)、肝细胞(PGB∶0007)、脾脏细胞(PGB∶00011)、THY+细胞(PGB∶00047)、支气管上皮细胞(PGB∶00081)、胎盘细胞(PGB∶00045)、人脐静脉内皮HUVEC细胞(PGB∶00031)。其中,脾脏细胞(PGB∶00011)、THY+细胞(PGB∶00047)等词条与提高人体免疫力高度相关。见图5。

2.2 分子对接结果

根据分子对接结果,发现SWT-H所含有效成分洋川芎内酯A可与MAPK1的周围氨基酸残基PHE(A∶33)、THP(B∶40)、TRP(B∶41)、TRP(A∶41)、HIS(B∶90)相互作用。SWT-H所含有效成分黄芪甲苷(Astragaloside IV)可与甲状腺素视黄质运载蛋白(transthyretin,TTR)的周围氨基酸残基ALA(A∶52)、VAL(A∶39)、LYS(A∶54)、CYS(A∶166)、LEU(A∶156)相互作用,提示该两种有效成分与该两种关键靶点有着较强的结合能力。见图6及图7。

3 讨论

近年来研究[6]表明,中药在提高人体免疫力方面有较好的优势,但机制尚未完全被阐明。诱导型一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase inducible,NOS2)是一种分布在人体全身的信使小分子,具有一定免疫调节功能。NO在一定条件下生成活性氮(reactive nitrogen species, RNS),RNS会和活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)共同提供氧化还原化学反应釜,构筑成人体对抗外来病原体感染的首道防线[7]。SWT-H中所含的有效成分,如焦地黄内酯(Jioglutolide)可有效地靶向作用于NOS2,推测其可通过影响多个器官内NOS2的表达,发挥调控RNS合成水平的作用,从而调节机体免疫功能。

巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)是一种来源广泛的内分泌免疫物质,可来源于机体免疫细胞和非免疫细胞,能够限制体内巨噬细胞的活动。通常情况下,MIF在巨噬细胞内保持高表达,从而使巨噬细胞保持静息状态。在一定刺激下,MIF可诱导巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α),并使γ干扰素(IFN-γ)诱导巨噬细胞产生NO,从而增强巨噬细胞对感染的反应能力。除对巨噬细胞的控制作用外,MIF还表现出促进T细胞的增殖的作用[8]。网络药理学分析表明,SWT-H所含多种有效成分,地黄苷A(Rehmannioside A)、6-甲氧基当归素(Sphondin)、焦地黄呋喃(Jiofuran)等,可靶向作用于MIF,发挥调节机体内巨噬细胞、T细胞等免疫细胞的增殖、迁移等功能,从而调控机体的免疫功能。除MIF外,许多靶点通路参与影响T细胞的增殖。如丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路。MAPK蛋白家族包括许多成员,其中p38MAPK,又称MAPK14,可促进T细胞增殖;特异性阻断MAPK14信号通路还可减少脾脏指数[9-10]。网络药理学分析表明,SWT-H含多种有效成分,如异黄芪皂苷 IV(Isoastragaloside IV)、洋川芎内酯 A(Senkyunolide A),可作用于MAPK1;地黄苷C(Rehmaionoside C)、地黄素D(Rehmaglutin D)可作用于MAPK14,激活MAPK通路,发挥增强免疫的功能。分子对接结果表明,洋川芎内酯 A与MAPK1有较好的结合能力,黄芪甲苷与TTR有较强作用力,同样也验证了网络药理学预测结果。除上述直接作用外,部分体内激素和营养物质对人体免疫力也起到关键作用,如甲状腺素、维生素A等。甲状腺激素参与免疫调节,在固有免疫和适应性免疫中发挥着重要作用[11];维生素A可影响消化道微生物结构、修复屏障功能、改善黏膜免疫反应,从而减少肠道感染[12]。这两种物质的水平均受到体内一种特殊转运蛋白,即甲状腺素视黄质运载蛋白(transthyretin,TTR)的调控。分子对接结果表明,SWT-H所含有效成分黄芪甲苷与TTR有较好的结合能力,推测该有效成分可靶向激活TTR,提高人体甲状腺激素和维生素A向重要器官的转运能力,从而增强人体免疫力。

综上,SWT-H可通过如下几种潜在机制,提高人体免疫力:(1)Jioglutolide调节NOS2/NOS3的表达水平,促进RNS合成,增强人体组织修复、对抗感染能力。(2)异黄Isoastragaloside IV、Senkyunolide A调控MIF在巨噬细胞内的表达,改善巨噬细胞功能,增强人体对抗病原能力。(3)Rehmaionoside C、Rehmaglutin D调控MAPK、MIF等相关靶点和通路,促进T细胞增殖。(4)黄芪甲苷靶向激活TTR,提高体循环种甲状腺激素和维生素A的转运能力,从而增强人体免疫力。