枯草芽孢杆菌Czk1 与化学杀菌剂复配对橡胶树炭疽病和白粉病的防效测定

尹建行，贺春萍，梁艳琼，李锐，张营,3

（1.贵州大学农学院，贵州 贵阳 550025；2.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海南 海口 571101；3.华中农业大学植物科学技术学院，湖北 武汉 430070）

橡胶树“两病”是橡胶树炭疽病和白粉病的合称，两种病害常混合发生，是影响橡胶干胶产量的主要病害，给我国天然橡胶产业带来了严重影响[1]。目前防治橡胶树“两病”的主要手段为化学防治，但因橡胶树树体高大导致施药器械缺乏、化学药剂用量大及药剂残留造成生态环境污染等问题，因此，亟待开发安全性高、效果好的新型药剂。

利用生防菌和化学杀菌剂联合防治植物病害能够使生防和化防形成优势互补，既能减少化学药剂的使用量[2]，减缓病原菌抗药性的产生和对环境的污染[3]，又能促进生防菌的定殖和生防效果的稳定性[4-6]，并且有些生防菌和化学杀菌剂还能相互促进，产生增效作用[7-9]。刘邮洲等[10]研究表明枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）sf628 与咪鲜胺锰盐复配对番茄枯萎病防效为75.95%~79.41%。张艳丽[11]研究发现生防木霉菌（Trichoderma spp.）与化学杀菌剂复配对辣椒疫病的田间防效显著优于单施化学杀菌剂，而且能够减少25%~32%双炔酰菌胺和10%丁子香酚的使用量。杨秀荣等[12]研究表明，生防菌B579 与多菌灵复配对蔬菜苗期立枯病有较好防效。尹敬芳[13]探究表明生防细菌BS 与烯酰吗啉可协同抑制辣椒疫霉病，减量50%的烯酰吗啉与BS 复配后的防治效果和烯酰吗啉单剂相当，并且还具有增效作用。以上研究表明，菌药协同防治植物病害具有较好的应用前景。

目前对于橡胶树“两病”在生物防治和菌药协同方面开展的研究较少，本实验室前期通过室内毒力测定和盆栽试验表明，枯草芽孢杆菌Czk1 与化学药剂25%丙环唑 戊唑醇、25%咪鲜胺复配后，对橡胶树炭疽病菌具有较好抑制作用，并筛选出了防治橡胶树炭疽病的最佳复配组合。在此基础上，本研究开展菌药最佳复配组合对橡胶树炭疽病和白粉病的田间防治试验，测定菌药复配剂对橡胶树“两病”的防治效果，探讨复配剂有无增效作用。以期为开发安全、高效的橡胶树炭疽病和白粉病的菌药复配使用技术提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

生防菌枯草芽孢杆菌Czk1 由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所热带特色经济作物病害实验室4℃低温保藏；LB 液体培养基参照谢立等[14]方法；化学杀菌剂详情见表1；ZWYR-D2403 型恒温培养振荡器购自上海智城分析仪器制造有限公司；3WF-3 型背负式喷雾喷粉机购自山东华盛中天机械集团；TSB-35（W）热力烟雾机购自深圳市隆瑞科技有限公司；紫外分光光度计购自德国耶拿分析仪器股份公司。

表1 3 种化学杀菌剂Table 1 3 kinds of chemical fungicides

1.2 生防菌液的制备

用无菌牙签挑取在LB 固体培养基上划线培养好的Czk1 菌株的单菌落，接入LB液体培养基中，于37℃，180 r/min 条件下摇床振荡培养12 h 即为生防菌Czk1菌液原液（OD600=2.137，菌液浓度=4.07 108cfu/mL）。

1.3 田间防效测定

试验地点在海南省儋州市中国热带农业科学院试验场7 队，供试橡胶品种热研7-33-97，橡胶种植年限4 年，田间验证25%丙环唑 戊唑醇、25%咪鲜胺和Czk1 单用和/或复配对橡胶树炭疽病和白粉病的防治效果。复配剂各浓度按照体积比Czk1:25%丙环唑 戊唑醇为7:3 或Czk1:25%咪鲜胺为8:2 配制[15]。试验随机区组设计4 次重复，每小区10 株橡胶树。试验处理：（1）Czk1+25%丙环唑 戊唑醇复配剂高浓度（Czk1菌液50 倍液+25%丙环唑 戊唑醇200 倍液）；（2）Czk1+25%丙环唑 戊唑醇复配剂中浓度（Czk1 菌液100倍液+25%丙环唑 戊唑醇500倍液）；（3）Czk1+25%咪鲜胺复配剂中浓度（Czk1 菌液100 倍液+25%咪鲜胺1 000 倍液）；（4）Czk1+25%咪鲜胺复配剂低浓度（Czk1 菌液200 倍液+25%咪鲜胺1 500 倍液）；（5）25%丙环唑 戊唑醇200 倍液；（6）25%丙环唑 戊唑醇500 倍液；（7）25%咪鲜胺1 000 倍液；（8）25%咪鲜胺1 500 倍液；（9）Czk1 菌液50 倍液；（10）Czk1 菌液100 倍液；（11）Czk1 菌液200 倍液；（12）16%百菌清咪鲜胺 三唑酮热雾剂250 mL/hm2；（13）水喷雾。各药剂有效成分的浓度见表2。每处理4 次重复，于2021年3 月始见橡胶树“两病”后喷雾（烟），各处理药液用量为1 000 L/hm2，按照每公顷喷施1 000 L 药液计算杀菌剂和生防菌原液的用量，再加水定容至1000L/hm2。隔7 d 重复喷雾1 次。于第1 次施药时调查记录病情基数，第2 次施药10 d后调查最终病情，并计算防效。橡胶树炭疽病的分级标准如下[16]，0 级：叶片无病斑；1 级：叶片有少量病斑，病斑占叶面积1%~5%；2 级：叶片有较多病斑，病斑占叶片面积6%~15%；3 级：叶片病斑占叶片面积16%~25%以下，或病斑在古铜叶基部1/2内的主脉上；4级：叶片病斑占叶片面积26%~50%，或病斑在古铜期叶基部；5 级：叶片病斑占叶片面积50%以上，或叶片严重畸形，或落叶，或芽枯死。橡胶树白粉病的分级标准如下[17]，0 级：无病斑；1 级：病斑面积占叶片总面积1%~5%；3 级：病斑面积占叶片总面积的6%~10%；5 级：病斑面积占叶片总面积的11%~15%，或叶片组织因病而轻度畸形；7 级：病斑面积占叶片总面积的16%~20%，或叶片因病而卷曲；9级：病斑面积占叶片总面积的20%以上，或叶片因病而严重卷曲。每小区随机选取5 株橡胶树，每株胶树东、南、西、北方向各取1 蓬叶，每蓬叶随机取5 片中间小叶（共100 片），进行病情基数调查。

表2 各处理药剂的有效成分及浓度Table 2 The active ingredient and concentration of each fungicide

病情指数和防治效果计算公式为：

病情指数=∑（各级叶片数 级值）/（调查总叶数最高病级）100

防治效果[18]（%）=[1-（空白对照区药前病情指数处理区药后病情指数）/（空白对照区药后病情指数 处理区药前病情指数）] 100；

1.4 Horsfall法测定复配剂对橡胶“两病”的协同能力

协同能力测定采用Horsfall 法并稍加改进，计算协同增效[13,19,20]。计算公式：

式中：IR 为增效比率；Eab 为混剂的实际防效；Eth为混剂的理论防效。Eth=单剂生防菌实际防效 配比中的百分率+化学杀菌剂实际防效 配比中的百分率。若IR>1，为增效作用；若IR<1，为拮抗作用；IR=1，为相加作用。

1.5 数据分析

运用IBM SPSS Statistics 22.0 软件和Excel 2016软件对数据进行统计和分析，采用LSD 法进行数据间的多重比较。

2 结果与分析

2.1 复配剂对橡胶树炭疽病的田间防治效果

试验结果表明（表3），防治橡胶树炭疽病效果最好的药剂组合是Czk1+咪鲜胺复配剂中浓度，防效为75.18%；其次是Czk1+25%丙环唑 戊唑醇复配剂高浓度、单剂25%丙环唑 戊唑醇200 倍液、单剂25%咪鲜胺1 000 倍液和单剂Czk1 菌液50 倍液，防效分别是58.24%、53.11%、54.20%和51.95%，除Czk1+25%丙环唑 戊唑醇复配高浓度处理外，其余3 个处理均显著低于Czk1+25%咪鲜胺复配剂中浓度的防效；Czk1+25%丙环唑 戊唑醇复配剂中浓度、Czk1+25%咪鲜胺复配剂低浓度、单剂25%咪鲜胺1 500 倍液和单剂Czk1 菌液100 倍液、200 倍液的防治效果与对照药剂16%百菌清 咪鲜胺 三唑酮的差异并不显著，防效分别为39.02%、35.99%、33.94%、42.55%、39.68%和25.57%；单剂25%丙环唑 戊唑醇500 倍液的防治效果最差，仅为10.38%，低于对照药剂，但差异并不显著。

表3 复配剂对橡胶树炭疽病的防治效果Table 3 Control efficacy of compound of Bacillus subtilis and fungicides on anthracnose of rubber tree

2.2 复配剂对橡胶树白粉病的田间防治效果

由表4 可知，防治橡胶树白粉病效果最好的药剂组合是单剂25%丙环唑 戊唑醇500 倍液和单剂25%咪鲜胺1 500 倍液，防效分别为82.11%和76.88%，两者的差异不显著；其次是Czk1+25%丙环唑 戊唑醇复配剂中浓度，防效为71.34%；防治橡胶树白粉病效果较好的是Czk1+25%丙环唑 戊唑醇复配剂高浓度、Czk1+25%咪鲜胺复配剂中和低浓度，防效分别为59.54%、64.27%和59.51%，显著优于对照药剂16%百菌清 咪鲜胺 三唑酮；单剂25%咪鲜胺1 000 倍液的防治效果和对照药剂16%百菌清 咪鲜胺 三唑酮相当，分别为51.90%和51.18%；单剂25%丙环唑 戊唑醇200 倍液、单剂Czk1 菌液50 倍液、100 倍液和200倍液的防治效果较差，显著低于对照药剂16%百菌清咪鲜胺 三唑酮，其中单剂Czk1 菌液100 倍液的防治效果最差，防效仅为27.66%，显著低于其他处理。

表4 复配剂对橡胶树白粉病的防治效果Table 4 Control efficacy of Bacilus subtilis and fungicides on powdery mildew of rubber tree

2.3 复配剂对橡胶树“两病”防治协同能力的影响

采用Horsfall 法分析复配剂对橡胶树炭疽病和白粉病的协同防治增效作用。如表5 所示，除Czk1+25%咪鲜胺复配剂低浓度的处理组对橡胶树炭疽病防治有拮抗作用外，其余复配剂处理组在防治橡胶树炭疽病和白粉病时均具有增效作用。在橡胶树炭疽病防治方面，增效作用最强的处理组是Czk1+25%咪鲜胺复配剂中浓度，增效比率为1.68；其次是Czk1+25%丙环唑 戊唑醇复配剂中浓度和Czk1+25%丙环唑 戊唑醇复配剂高浓度，增效比率分别为1.19 和1.11。在橡胶树白粉病防治方面，增效作用最强的复配剂处理组是Czk1+25%咪鲜胺复配剂中浓度，增效比率为1.98；增效作用较强的处理组是Czk1+25%丙环唑 戊唑醇复配剂高浓度和中浓度，增效比率分别为1.49 和1.62，而Czk1+25%咪鲜胺复配剂低浓度的增效作用稍弱。总体来看，Czk1+25%咪鲜胺复配剂中浓度和Czk1+25%丙环唑 戊唑醇复配剂中浓度对橡胶树两种叶部病害的防治均具有较好的增效作用，而Czk1+25%咪鲜胺复配剂低浓度对橡胶树“两病”防治未有明显增效作用。

表5 复配剂对防治橡胶树炭疽病和白粉病的增效作用Table 5 Synergistic effect of compound on control of anthracnose and powdery mildew of rubber tree

3 讨论

橡胶树是典型的热带雨林多年生乔木，其所产天然橡胶是我国重要的战略物质资源，然而天然橡胶的生产因受炭疽病和白粉病严重危害导致胶树落叶、枝条枯死，推迟开割时间2~3 个月，严重影响了天然橡胶的产量和质量，有效防治以上两种橡胶树重要病害具有重大意义。目前，尽管利用化学防治的方法可对橡胶树“两病”进行有效的控制，但化学防治易造成病原菌产生抗药性、杀菌剂用药量大及生态环境污染等问题。近年来，利用生防菌与化学杀菌剂联合防治植物病害的研究成为热点[21-24]，但对橡胶树病害进行菌药协同防治的研究鲜见报道。本研究中的枯草芽孢杆菌Czk1 是由本实验室从橡胶树根部分离获得[25]，其抑菌活性物质能较好抑制橡胶树的炭疽病、白粉病和根病病原菌生长[26-28]，谢立等[15]研究化学杀菌剂与枯草芽孢杆菌Czk1 复配对橡胶树炭疽病菌的抑制活性结果表明，Czk1 与化学杀菌剂25%丙环唑 戊唑醇、25%咪鲜胺均具有较好的相容性，并且两两复配对橡胶树炭疽病菌的抑菌活性具有明显增效作用，但Czk1 与化学杀菌剂对橡胶树病害的田间防治效果尚不明确，阻碍了其进一步开发和应用。因此，研究菌药联合对橡胶树“两病”田间作用的效果及机制，对于进一步推动生防菌与化学药剂协同防治橡胶树病害的应用具有较大意义。基于前期研究结果，本研究在田间评价了生防枯草芽孢杆菌Czk1 与化学杀菌剂协同对橡胶树“两病”防效的影响及其增效作用。菌药协同对橡胶树“两病”田间防治试验结果表明，与常规热雾剂16%百菌清 咪鲜胺 三唑酮的防效相比，两种菌药复配剂（Czk1+25%咪鲜胺和Czk1+25%丙环唑 戊唑醇）对橡胶树“两病”的防效均有较大提高，其中Czk1+25%咪鲜胺复配剂的中浓度对橡胶树炭疽病的防效达75.18%，比对照药剂提高了49.61%；Czk1+25%丙环唑 戊唑醇复配剂的中浓度对橡胶树白粉病的防效为71.34%，比对照药剂16%百菌清 咪鲜胺 三唑酮提高了20.16%。生防细菌和杀菌剂联合作用，为化学杀菌剂的减量施用提供了很好的途径。Kondoh 等[29]报道利用枯草芽孢杆菌与减半化学杀菌剂复配，对西红柿立枯病和梨果病害的防效比使用单剂高；姚克兵等[30]利用枯草芽孢杆菌与减半用量化学杀菌剂对草莓病害的防效优于二者单用；谢立[31]研究表明枯草芽孢杆菌Czk1与25%咪鲜胺和25%丙环唑 戊唑醇复配对橡胶树炭疽病菌抑菌作用明显优于单剂，但未进一步进行田间试验验证。在本研究中，田间试验结果显示，对于橡胶树炭疽病，枯草芽孢杆菌Czk1 与25%咪鲜胺、25%丙环唑 戊唑醇分别复配防治炭疽病的效果优于两种化学杀菌剂单用，与谢立[31]的研究结果相似；而对于橡胶树白粉病，菌药复配剂防治白粉病的效果略低于二者单用的中低浓度，与上述学者的研究结论不一致，可能与田间复杂的环境状况、病害发生流行等多种因素有关。在Czk1+25%咪鲜胺复配剂和Czk1+25%丙环唑 戊唑醇复配剂中25%咪鲜胺和25%丙环唑 戊唑醇的占比分别为20%和30%，这意味着在25%咪鲜胺减量80%和25%丙环唑 戊唑醇减量70%的条件下，菌药复配剂仍然有很好的防效，与韩丽等[32]的研究结论相似，说明本研究中的两种菌药复配剂具有很好开发成为新型药剂的潜力，研究结果对当前橡胶树“两病”绿色防控具有重大指导作用。

通过Czk1 和25%咪鲜胺、25%丙环唑 戊唑醇分别复配后的田间防效测定，发现在防治橡胶树“两病”时出现了较强增效作用。可能是由于25%咪鲜胺、25%丙环唑 戊唑醇的存在抑制或减少了其他病原微生物的竞争，导致叶围上营养供给相对增加，提高了Czk1在橡胶树体内存活率和定殖能力。枯草芽孢杆菌Czk1是橡胶树的内生菌[25]，其发酵液、抗菌提取物和挥发性物质都具有较强的抑菌活性，而且还能诱导橡胶树产生系统性抗性，其定殖能力的增强有利于增加其发挥抗菌和防病促生能力[33]，这与邱雪迎等[34]的研究结果一致。

综上所述，枯草芽孢杆菌Czk1 可分别与25%丙环唑 戊唑醇、25%咪鲜胺复配，能有效地防治橡胶树炭疽病和白粉病，而且菌药复配对橡胶树“两病”防治具有明显的增效作用，因此，Czk1 与25%丙环唑 戊唑醇、25%咪鲜胺菌药复配具备开发成为有效防治橡胶树“两病”的新型药物的潜能。本研究为橡胶树“两病”绿色防控技术应用提供了参考依据，但关于Czk1与25%丙环唑 戊唑醇、25%咪鲜胺复配对橡胶树“两病”防治的增效机理还需进行深入的研究。