三种色胺类物质诱导的小鼠条件性位置偏爱研究

2023-06-13李楠李锋魏佳韵乔艳玲李香豫王优美徐鹏狄斌

中国药物滥用防治杂志 2023年5期

李楠，李锋，魏佳韵，乔艳玲,3，李香豫，王优美,3，徐鹏,3*，狄斌*

（1.中国药科大学，江苏南京 210009；2.国家禁毒委员会办公室-中国药科大学禁毒关键技术联合实验室，北京100193；3.毒品监测管控与禁毒关键技术公安部重点实验室，公安部禁毒情报技术中心，北京100193）

色胺类物质是一类以色胺为母核的化学物质，具有与神经递质5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）相似的化学结构和药理作用，通过与5-HT 受体结合产生致幻效应，其致幻效应强烈，作用时间长，严重威胁吸食者健康和公共安全[1]。α-甲色胺（alpha-methyltryptamine，AMT）、5-甲氧-α-甲色胺（5-methoxy-alpha-methyltryptamine，5-MeO-AMT）和5-甲氧-N，N-二异丙色胺（5-methoxy-N，N-diisopropyl tryptamine，5-MeO-DiPT）是三种合成色胺类物质，在国内均被列入《非药用类麻醉药品和精神药品》，受到了严格管控，但在国际上，尽管AMT 已受到联合国1971 年《精神药物公约》的管控，但5-MeOAMT 与5-MeO-DiPT 只在部分国家受到了管控，且近几年仍有较多滥用现象[1-3]。有研究认为色胺类物质精神依赖性较低，但相关研究较为匮乏[4]。3，4-亚甲基二氧甲基苯丙胺（MDMA）是常见毒品摇头丸的主要活性成分，具有较强的精神依赖性和致幻作用。MDMA 与5-HT 受体也具有一定亲和力，而且MDMA 引起实验动物的“摇头”现象与色胺类物质引起实验动物的“甩头”现象类似[5]。本研究通过条件性位置偏爱（Conditioned Place Preference，CPP）实验，以MDMA 为阳性对照，对三种色胺类物质AMT、5-MeO-AMT 和5-MeO-DiPT 的奖赏效应进行评估，并对其精神依赖性大小进行比较，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SPF 级ICR 雄性小鼠，体重18～22 g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2019-0010。动物房温度控制在20～25℃，相对湿度控制在50%～65%，12 h 明暗循环照明。实验开始前，动物在动物房至少适应环境1～2 d，饲料与清洁水可自由摄取。对实验动物进行的操作均符合实验动物伦理学，遵循国家动物使用和保护委员会颁布的相关条例。

1.2 实验药品与试剂

AMT、5-MeO-AMT、5-MeO-AMT、5-MeO-DiPT、MDMA 由公安部禁毒情报技术中心提供，纯度均≥98%。0.9%氯化钠注射液（生理盐水），购自山东齐都药业有限公司。四种化合物均采用0.9%氯化钠注射液溶解，实验前新鲜配制。阴性对照组给予0.9%氯化钠注射液。

1.3 实验设备

条件性位置偏爱箱（以下简称CPP 箱）及CPP 视频分析系统（北京众实迪创科技发展有限责任公司）。CPP 箱采用三室式CPP 箱（400 mm×150 mm×350 mm），箱体的材料为医用PVC，并由两块活动隔板分成左、中、右三室。左右室（170 mm×150 mm×350 mm）大小相等。左室内壁黑色，底部为圆点状镂空底板，右室内壁为黑白相间的条纹，底部为圆点与条状相间镂空底板。高清摄像头安装于CPP 箱正上方以记录小鼠的活动情况，使用Tracking Master V3.63计算机软件记录每个小鼠在每个隔间停留的时间。

1.4 动物分组及给药

将前筛合格的实验小鼠按体重随机分为5 大组：阴性对照组（生理盐水）、MDMA 不同剂量组（分别为1 mg/kg，3 mg/kg，10 mg/kg）、AMT 不同剂量组（分别为3 mg/kg，10 mg/kg，30 mg/kg）、5-MeOAMT 不同剂量组（分别为3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg）和5-MeO-DiPT 不同剂量组（分别为3 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg）。各剂量组小鼠8～12 只，腹腔注射，固定体积给药。

1.5 实验方法

实验前一天，将小鼠放入CPP 箱中以适应环境。正式实验包括3个阶段：前筛、给药训练和表达测试[6]。第1 天进行前筛：将小鼠从中间室放入CPP 箱内，使其在箱内自由活动15 min，测定小鼠的天然偏爱倾向。将小鼠天然非偏爱侧（右室）作为伴药箱，另一侧（左室）作为非伴药箱，剔除在左右两室中天然偏爱差异较大的小鼠（剔除标准：小鼠在左右两室停留时间差值＞120s）。将前筛合格的小鼠进行分组。第2～6 天进行给药训练：放入活动隔板以阻断CPP 箱内通道，各组小鼠每天上午腹腔给药，立即放入伴药箱停留45 min，下午给予生理盐水，立即放入非伴药箱停留45 min，阴性对照组小鼠每天上下午都给予生理盐水，上下午给药的时间间隔≥6 h。第7 天进行表达测试：在给药训练的最后一次给药的24 h 后进行测试。表达测试当天不给药。将活动隔板取出，将小鼠从中间室放入CPP 箱内，使其在箱内自由活动15 min。分别记录小鼠在伴药箱和非伴药箱内停留的时间。计算CPP 分数，计算公式为：CPP 分数=伴药箱停留时间-非伴药箱停留时间。

1.6 统计学方法

采用GraphPad Prism 8 软件进行实验数据处理，计量资料以（±SEM）表示，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）和Bonferroni post hoc检验，以P＜0.05 被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MDMA 的CPP 实验结果

单因素方差分析显示，不同剂量的MDMA[F（3，29）=18.36，P＜0.0001]对CPP 分数有显著性影响，CPP 分数与给药剂量在实验剂量范围内呈正相关；Bonferroni post hoc 检验显示，与阴性对照组相比，MDMA 在剂量为3mg/kg 和10mg/kg 时能显著影响CPP 分数的表达，即能使小鼠对伴药箱产生显著的位置偏爱。在一定范围内，随着给药剂量的增加，MDMA 诱导的小鼠CPP 分数表达逐渐增强，见图1。

图1 不同剂量的MDMA 腹腔给药训练后测得的CPP 分数

2.2 三种色胺类物质的CPP 实验结果

单因素方差分析显示，不同剂量的AMT[F（3，30）=3.877，P=0.0187]对CPP 分数有显著性影响；Bonferroni post hoc 检验显示，与阴性对照组相比，AMT 在剂量为30mg/kg 时能诱导小鼠对伴药箱产生显著的位置偏爱（图2A）。不同剂量的5-MeO-AMT[F（3，35）=4.763，P=0.0069]对CPP 分数有显著性影响；Bonferroni post hoc 检验显示，与阴性对照组相比，5-MeO-AMT 在剂量为30mg/kg 时能诱导小鼠对伴药箱产生显著的位置偏爱（图2B）。与阴性对照组相比，不同剂量的5-MeO-DiPT 对CPP 分数的表达均无显著性差异（图2C）。

图2 不同剂量的AMT（A）、5-MeO-AMT（B）、5-MeO-DiPT（C）腹腔给药训练后测得的CPP 分数

3 讨论

3.1 给药剂量对CPP 分数的影响

本研究结果显示，MDMA 引起小鼠产生CPP 行为的最小有效剂量为3 mg/kg，而AMT 和5-MeOAMT 的剂量则需要达到30 mg/kg 时才能引起小鼠产生显著的CPP 行为，在本研究剂量范围内，5-MeODiPT 不能诱导小鼠产生CPP 行为。分析认为，CPP实验是评价药物奖赏效应的经典动物实验模型，广泛应用于药物精神依赖性初步评价。该模型建立的理论依据是巴普洛夫经典条件反射，首先通过反复训练使动物在环境刺激与药物作用之间建立联系，然后通过测试动物对该环境的偏爱程度来测定该药物的奖赏作用强度[7]。因此，CPP 实验可评估药物的奖赏效应和药物滥用潜在威胁，常用于初步筛查某种药物是否具有成瘾性。MDMA 是常见毒品“摇头丸”的主要活性成分，能产生致幻作用，对其精神依赖性的研究较多，相关研究显示[8]，MDMA 腹腔给药剂量为5 mg/kg 时能诱导小鼠产生显著的CPP行为，而本研究中MDMA 引起小鼠产生CPP 行为的最小有效剂量（3 mg/kg）与之接近。另有研究[9，10]采用CPP 实验和自身给药实验评估了5-MeO-AMT、吡咯烷基色胺、哌啶基色胺、N，N-二丁基色胺和2-甲基色胺的精神依赖性，结果表明这五种色胺类物质均不能诱导实验动物的CPP 行为和自身给药行为，其中5-MeO-AMT 的CPP 实验只研究了0.3mg/kg、1mg/kg 和3mg/kg 这三个较低的剂量，且均不能诱导小鼠产生显著的CPP 行为。而本研究结果显示，尽管5-MeO-AMT 在剂量为3mg/kg 和10mg/kg 时也不能诱导小鼠产生显著的CPP 行为，但5-MeO-AMT在剂量为30mg/kg 时能够诱导实验动物的显著CPP行为，提示色胺类物质在大剂量长期使用的情况下可能会产生明显的精神依赖性。

通常情况下，在相同条件下诱导实验动物开始形成CPP 的剂量越小，说明该物质引起奖赏效应的能力越强。AMT 和5-MeO-AMT 形成CPP 的剂量是MDMA 的10 倍，一定程度上可反映AMT 和5-MeOAMT 的奖赏效应较弱，5-MeO-DiPT 几乎不具有奖赏效应。以上结果说明了在这几种物质中，MDMA的奖赏效应最强，与MDMA 相比，三种色胺类物质的奖赏效应较低，其精神依赖性大小相对效力如下：MDMA＞AMT ≈5-MeO-AMT＞5-MeO-DiPT。此外，尽管5-MeO-DiPT 在本研究的剂量范围内均不能引起小鼠的CPP 行为，但在实验过程中观察到，5-MeODiPT 剂量增加到60 mg/kg 时出现了个别小鼠死亡的现象，提示该剂量可能接近其半数致死剂量，但该剂量下仍不能诱导小鼠产生CPP行为，表明5-MeO-DiPT毒性较强但精神依赖性可能较低。

3.2 影响CPP 结果的可能神经生物学机制分析

MDMA 和三种色胺类物质在奖赏效应上的差异可能与该物质对不同脑区单胺类神经递质的不同作用有关。目前普遍认为，脑内奖赏效应可能是产生精神依赖性和强迫性觅药行为的主要原因，中脑边缘多巴胺（DA）通路是药物奖赏效应形成的重要神经生物学基础，5-羟色胺（5-HT）主要对DA起负性调节的作用，因此在药物的精神依赖性研究中，DA 和5-HT 是研究较多的两种单胺类神经递质。MDMA 能激活5-HT 受体和DA 受体，从而产生各种生物学效应。相关研究表明[11]，D1 受体和D2 受体拮抗剂能使MDMA 大鼠自身给药模型中的剂量-效应曲线右移，证明MDMA 奖赏效应的产生与DA受体的功能改变相关。

而色胺类物质主要通过激活5-HT 受体产生药理作用，对DA 受体的作用则相对较弱。Nagai F等[12]研究表明，AMT、5-MeO-AMT 和5-MeODiPT 对5-HT 在大鼠脑中的再摄取均有抑制作用，其中AMT（IC50=3.8±0.74×10-7M）的效力与MDMA（IC50=7.2±1.9×10-7M）相当。放射性受体配体结合研究显示[13]，在色胺类物质中，5-MeO-AMT 与5-HT2A受体的亲和力最强（Ki±SD=0.034±0.01 μM），而对DA 受体的亲和力较弱。此外，5-MeO-DiPT 对不同脑区内DA 和5-HT 的作用强度可能不同，DA 和5-HT两种神经递质的释放也可能相互影响其具体的机制，需要进一步研究[14]。

CPP 实验只是判断药物是否具有精神依赖性的初步实验，很多自然性奖赏物质如甜食等也可形成CPP，实验数据也可能存在较高的假阳性率[15]。此外，色胺类物质普遍具有强烈的致幻效应，致幻效应是一种视觉、听觉和触觉等感觉上的主观效应，实验动物在给予致幻剂类物质后可能会丧失对外部环境的判断能力，产生错误的主观感觉，因此仅通过CPP 实验评估色胺类物质的奖赏效应并不准确。要想得到确定的结果还需要进一步评估，如结合可信度更高、在药物成瘾研究中更为经典的自身给药实验和药物辨别实验等对色胺类物质进行进一步研究。