超高效液相色谱串联质谱法测定水产品中孔雀石绿和地西泮的含量

◎ 朱欣欣，崔倩倩，刘 琳，刘 璐，周莹莹，贾松涛，付燕峰，赵林萍

（1.河南中标检测服务有限公司，河南 郑州 450001；2.郑州市食品药品检验所，河南 郑州 450001；3.郑州中道生物技术有限公司，河南 郑州 450001）

孔雀石绿应用在水产品中是一种很好的抗菌剂，能提高水产品的存活率，因此孔雀石绿被广泛应用在水产品中[1]。1992 年，孔雀石绿被国际癌症研究机构列为二类致癌物。人体长期食用后，容易在体内富集，引起身体内脏、眼睛、血液、脾、皮肤等器官和身体组织慢性中毒[2]。

地西泮属于二类精神类药物，人体长期摄入后，可能会出现嗜睡疲乏、动作失调等症状，严重者还可能出现心律失常、昏迷、精神错乱等情况[3]。若孕妇及哺乳期妇女使用，会增加致畸风险，新生儿会呈现撤药症状以及肌张力低下等。《中华人民共和国农业部公告第235 号》中将地西泮规定为“允许作治疗用，但不得在动物性食品中检出的药物”[4]。本文主要研究了超高效液相色谱串联质谱法同时测定水产品中孔雀石绿和地西泮的含量。

1 材料与方法

1.1 样品

淡水鱼，绞碎并均质，-18 ℃保存。

1.2 试剂与标准品

甲醇（色谱级）；乙腈（色谱级）；甲酸（色谱级）；正己烷；孔雀石绿（批号1125838，纯度93.2%，美国DR）；孔雀石绿D5（批号G1062742，纯度81.47%，美国DR）；地西泮（批号FE12021903，纯度100%，SIGMA-ALDRICH）。

1.3 仪器与设备

TSQ vanquish 超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪：配有电喷雾（ESI）离子源；天平：感量为0.01 g；水浴锅；振荡器；离心机；超声波；0.22 μm微孔有机相滤膜。

1.4 实验方法

1.4.1 标准溶液的配制

（1）孔雀石绿标准储备液（100 mg·L-1）。避光称取10 mg 孔雀石绿标准品至100 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容，-18 ℃保存。

（2）孔雀石绿-D5 标准储备液（100 mg·L-1）。避光称取10 mg 孔雀石绿-D5 标准品至100 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容，-18 ℃保存。

（3）地西泮标准储备液（100 mg·L-1）。避光称取10 mg 地西泮标准品至100 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容，-18 ℃保存。

（4）混合标准工作液（100 ng·mL-1）。避光下分别吸取100 μL 孔雀石绿和地西泮标准储备液至100 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容，-18 ℃保存。

（5）孔雀石绿-D5 标准工作液（100 ng·mL-1）。避光下吸取100 μL 孔雀石绿-D5 标准储备液至100 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容，-18 ℃保存。

1.4.2 测定步骤

（1）提取。避光称取样品2.0 g（精确到0.01 g）于50 mL 棕色离心管中，加入孔雀石绿-D5 标准工作液40 μL，涡旋混匀1 min，加入20 mL 1%甲酸乙腈进行提取，8 000 r·min-1匀浆提取10 min，超声提取5 min，8 000 r·min-1离心5 min，上清液全部取出转移至另一个离心管中，20 mL 1%甲酸乙腈加入残渣离心管中重复上述步骤进行提取，提取完后合并两次上清液，45 ℃水浴锅氮气吹至近干，加入1 mL乙腈定容，旋涡混合，待净化（样品在前处理过程中，应避免强光直射[5]）。

（2）净化。待净化液加入5 mL 正己烷进行除脂，涡旋混合1 min，静待分层，吸取下层液，过0.22 μm滤膜至棕色进样瓶中，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。

1.4.3 仪器条件

（1）色谱条件。色谱柱：MG Ⅱ C18（2.0 mm×150 mm，3 µm）；流动相：水（A）+0.1%甲酸甲醇（B）；梯度洗脱：0 ～1 min，80%A+20%B；1.0 ～3.5 min，5%A+95%B，3.5 ～5.0 min，80%A+20%B； 流速：0.25 mL·min-1；进样量：5 μL。

（2）质谱条件。电喷雾离子源（ESI）、正离子扫描、多反应监测（SRM）方式。

1.4.4 标准曲线配制

吸取混合标准工作液（100 ng·mL-1）0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.50 mL、5.00 mL 和10.00 mL 于50 mL棕色容量瓶中，向其分别加入2 mL孔雀石绿-D5标准工作液（100 ng·mL-1），用1%甲酸乙腈定容，配制成浓度为0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1的孔雀石绿和地西泮混合标准溶液，孔雀石绿-D5 浓度为4 ng·mL-1，临用现配。

2 结果与分析

2.1 质谱优化结果

在质谱条件下对孔雀石绿、孔雀石绿-D5 以及地西泮的母离子及子离子进行优化，结果见表1，离子对色谱图见图1、图2 和图3。

图1 孔雀石绿离子对色谱图

图2 孔雀石绿-D5 离子对色谱图

图3 地西泮离子对色谱图

表1 待测物定性离子对、定量离子对、碰撞能量、锥孔电压的优化结果表

2.2 线性方程

由表2 可知，孔雀石绿、地西泮在0.5 ～20.0 ng·mL-1有良好的线性关系。相关系数R2均大于0.999 0。方法的检测低限为0.5 ng·mL-1。

表2 孔雀石绿和地西泮的线性方程和相关系数表

2.3 回收率以及精密度实验

在淡水鱼中添加孔雀石绿-D5 标准工作液，质控浓度溶液分别为5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1，进行平行实验，计算加标回收率和精密度。由表3可知，样品回收率在82.1%～96.1%，精密度在2.9%～7.8%。

表3 样品的精密度和加标回收率结果表

2.4 实际样品检测

采用本方法对多个地市抽取的水产品进行测定，结果显示孔雀石绿和地西泮均有检出，且回收率较高，说明市场上水产品中仍含有一定量的孔雀石绿和地西泮，存在食品安全隐患。

3 结论

本研究建立了一种 HPLC-MS/MS 同时测定水产品中孔雀石绿和地西泮的方法。结果表明，采用该法测定的结果准确，灵敏度高，适用于实验室日常检测。