山茱萸水提物对UVB 所致HaCaT 细胞光老化模型的保护作用

2023-06-13张逍遥杨筱舟张小莺

现代食品 2023年7期

◎ 张逍遥，杨筱舟，向甜，张小莺

(陕西理工大学生物科学与工程学院秦巴生物资源与生态环境省部共建国家重点实验室（培育），陕西汉中 723000）

由于中波紫外线（Ultraviolet B，UVB）的波长较短极易被皮肤吸收，因此是造成皮肤光老化的主要辐射类型[1]。山茱萸（Cornus officinalisSieb. et Zucc.）的成熟果肉富含酚类和环烯醚萜等多种活性成分[2]。本研究用UVB 照射HaCaT 细胞构建光老化模型，通过检测山茱萸水提物（Cornus officinalisWater Extract，COW）对经UVB 照射HaCaT 细胞的抗氧化酶活力的影响，在细胞层面验证COW 抗光老化的能力。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

HaCaT 细胞、DMEM 培养基和胰蛋白酶，购自武汉尚恩生物科技公司；山茱萸果，购自陕西金慧方中药科技公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、BCA 蛋白浓度和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）试剂盒，均购自上海碧云天生物技术公司；葡萄糖、芦丁和没食子酸标准品，购自上海源叶生物科技公司。

UVB 紫外灯，购自南京华强电子公司；紫外辐照检测计和UVB-X0 探头，购自深圳市林上科技公司。

1.2 方法

1.2.1 提取山茱萸水提物

取100 g果肉加入500 mL水中，60 ℃超声提取1 h，后20 000×g 离心20 min，收集上清，沉淀，重复上述步骤，二次离心后再重复上述步骤，合并3 次上清进行热回流提取，经冷冻干燥获得COW[3]。

1.2.2 COW 中总多糖、总多酚和总黄酮含量测定

（1）采用苯酚-硫酸法测总多糖含量[4]。以葡萄糖标准品为对照建标准曲线，配制不同浓度梯度葡萄糖溶液为待测液（0 mg·mL-1、30 mg·mL-1、60 mg·mL-1、90 mg·mL-1和120 mg·mL-1），然后取1 mL 待测液、1 mL 6%苯酚和5 mL 浓H2SO4于25 ℃避光20 min 后30 ℃水浴25 min，测定490 nm 处吸光值；后用同样方法测1 mg·mL-1COW 的吸光值。

（2）采用Folin-酚比色法测总多酚含量[4]。以没食子酸标准品为对照建标准曲线，配制不同浓度梯度的没食子酸溶液为待测液（0 mg·mL-1、55.5 mg·mL-1、111.0 mg·mL-1、222.0 mg·mL-1和277.5 μg·mL-1），然后取100 μL 待测液与400 μL 水和500 μL Folin-酚混合避光2 min 后加入2 mL 7.5% Na2CO3溶液，于40 ℃孵育30 min，测定760 nm 处吸光值；后用同样方法测5 mg·mL-1COW 的吸光值。

（3）采用NaNO2-Al(NO3)3比色法测总黄酮含量[4]。以芦丁标准品为对照建标准曲线，配制不同浓度梯度的芦丁溶液为待测液（0 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、150 μg·mL-1和250 μg·mL-1），然后取100 μL 待测液与100 μL 5% NaNO2溶液混合，5 min后加入100 μL 10% Al(NO3)3溶液，5 min 后加入400 μL 4.3% NaOH 溶液室温5 min，测定510 nm 处吸光值；后用同样方法测5 mg·mL-1COW 的吸光值。

1.2.3 COW 的抗氧化能力

将COW 配制成1.00 mg·mL-1、0.50 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1和0.05 mg·mL-1待测液。50 μL 待测液与150 μL 140 μg·mL-1DPPH·混合常温避光30 min，测定517 nm 吸光度，以抗坏血酸（Vc）为阳性对照[4]。DPPH·清除率按公式（1）计算。

将5 mL 7 mmol·L-1ABTS 溶液和43 μL 140 mmol·L-1K2S2O8溶液混合避光16 h，后用水稀释至在734 nm 处的吸光值为0.700±0.020 时即配成ABTS 工作液。25 μL 待测液和150 μL ABTS 工作液混合测定734 nm 吸光度，以Vc 为阳性对照[4]。ABTS自由基清除率按公式（1）计算。

式中：A1为待测液与自由基混合测定的吸光度值；A0为无水乙醇代替自由基溶液测定的吸光度值；A2为用纯水代替待测样品与自由基混合测定的吸光度值。

1.2.4 COW 对HaCaT 细胞存活率的影响

将HaCaT 细胞用DMEM 培养基培养于37 ℃ 5%CO2恒温培养箱中，生长至对数期即可进行试验[1]。细胞以1×104个/孔的浓度接种于96 孔板并培养24 h 后，将原有培养基按分组换为不同浓度COW 的DMEM培养基（10.0 mg·mL-1、8.0 mg·mL-1、6.5 mg·mL-1、5.0 mg·mL-1、4.0 mg·mL-1、3.5 mg·mL-1、3.0 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1和1.0 mg·mL-1）培养24 h，使用CCK-8 试剂盒检测细胞存活率。测定时，每孔中分别加入10 μL CCK-8，继续培养2 h，测定450 nm 处吸光值。每组的存活率由该组吸光值除以空白组（0 mg·mL-1COW）吸光值得到。

1.2.5 HaCaT 细胞光老化模型建立

HaCaT 细胞接种于96 孔板培养24 h 后将原有培养基替换为PBS，不同剂量UVB 辐射（62.433 2 mJ·cm-2、123.634 9 mJ·cm-2、261.676 7 mJ·cm-2、389.581 7 mJ·cm-2和643.399 1 mJ·cm-2）后将培养基替换成DMEM 培养24 h，细胞存活率测定同1.2.4。在Excel 中用“Forecast”公式算出细胞存活率为50%时的UVB 辐照强度（IC50）用于建模[1]。

1.2.6 COW 对UVB 诱导的光老化HaCaT 细胞存活率的影响

实验分为模型组（Model）、空白组（NC）、阳性对照组（PC）和COW 高、中和低剂量组（CH、CM和CL）。Model、NC和PC在DMEM培养基中培养，CH、CM 和CL 在含有1.00 mg·mL-1、0.50 mg·mL-1和0.25 mg·mL-1COW 的DMEM 培养基中培养。24 h 后将培养基替换为PBS，除NC 外其他组用354.128 mJ·cm-2的UVB 进行辐射，后将PBS 换为DMEM 培养基培养4 h，细胞存活率测定同1.2.4。

1.2.7 细胞氧化因子的检测

每孔加入100 μL IP 细胞裂解液，待裂解液将细胞充分裂解后，将细胞裂解液收集起来。之后利用GSHPx、SOD 和MDA 检测试剂盒分别检测其活力和含量。

1.3 数据分析

用Graphpad Prism 9、SPSS Statistics 26 和Excel 2016 软件进行制图和数据分析，实验结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 COW 的总多糖、总多酚和总黄酮含量及其抗氧化能力

总多糖、总多酚和总黄酮回归方程及线性系数如表1所示。COW 中三者含量分别为（870.51±15.66）μg·mg-1、（37.89±1.25）μg·mg-1和（11.97±0.27）μg·mg-1。抗氧化结果表明COW 清除ABTS 自由基和DPPH 自由基的IC50为（50.19±0.22）mg Vc·g-1和（25.21±2.13）mg Vc·g-1。

表1 总多糖、总多酚和总黄酮标准曲线表

2.2 UVB 和COW 对HaCaT 细胞存活率的影响

UVB 剂量越大细胞存活率越低（图1a）。据“Foercast”函数算出UVB 对于细胞存活率的IC50值为（354.128 ± 71.93）mJ·cm-2，故选此强度构建HaCaT 光老化模型。

图1 不同剂量UVB 和COW 的HaCaT 细胞存活率图

COW 浓度越高细胞存活率越低（图1b）。COW浓度为1 mg·mL-1时细胞存活率为93.61%，可视为此浓度对细胞无毒性。故高、中和低剂量组COW 浓度设为1.00 mg·mL-1、0.50 mg·mL-1和0.25 mg·mL-1。

2.3 COW 对UVB 所致光老化HaCaT 细胞存活率和氧化因子的影响

CH 和CM 均能显著提高经UVB 照射后的细胞存活率，CL 组高于Model 组但并不显著（图2）。CH、CM 和CL 组细胞存活率随COW 浓度减小而下降，且CH 显著高于CL。

图2 不同分组的细胞存活率图

较NC，Model 细胞GSH-Px 和SOD 活性显著降低，MDA 含量显著高于NC，GSH-Px 和SOD 活性随COW 浓度增加而提高，MDA 含量随COW 浓度增加而减少（图3）。

图3 不同分组的GSH-Px 和SOD 酶活性以及MDA 的含量图

3 讨论

生物体正常行使功能依赖于稳定的氧化还原状态，此状态的平衡靠机体内部的氧化还原系统来维持[5]。过量UVB 辐射破坏皮肤氧化还原平衡，导致细胞死亡[1]。本研究发现COW 有抗氧化活性，故对COW 是否对UVB 所致HaCaT 光老化模型有保护作用进行研究。

COW 能提高经UVB 辐射后HaCaT 的SOD 和GSH-Px 活性，降低MDA 含量，从而增加细胞存活率（图3）。黑枸杞水提物也可以提高UVB 照射后HaCaT 的存活率[1]，但对比发现山茱萸对UVB 所致HaCaT 光老化模型保护能力更加突出。1 mg·mL-1的COW 可将HaCaT 细胞存活率提升20%，而1 mg·mL-1黑枸杞水提物仅能提升16%，这为COW 作为抗UVB辐射产品原料提供了理论依据。

本研究只对COW 的抗UVB 功效进行初步了解，有必要对山茱萸不同组分和单体进行深入的研究，并从生化与细胞层面深入探究。