藠头纯种低盐发酵工艺的优化研究

◎ 王雪郦，帅 莲，刘雪婷，王璐瑶

（1.贵州大学 贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）

藠头（Allium chinenseG. Don）又称荞头和薤等，属百合科、葱属多年生宿根性草本植物。藠头富含蛋白质和人体所需的多种矿物质、维生素等，具有开味、祛腥、健胃、顺气[1-2]、保护心血管系统健康[3]、抗菌抑菌、抗癌防癌[4-5]、抗氧化和增强免疫力[6]等功效。目前，主要采取浸泡发酵的方式对藠头进行加工[7]，以此减少藠头自身的辛辣、冲味，增加酸辣、嫩脆的口感[8]。但是传统藠头的加工多采用自然发酵工艺，该方法不仅发酵周期长、不利于产品规模化及标准化生产，而且产品易出现亚硝酸盐累积现象[9-10]。亚硝酸盐是亚硝胺和亚硝基酰胺等致癌物质的前体，对人体健康和安全构成较大威胁[11-13]，故如何减少发酵食品中亚硝酸盐的生成是研究的热点。刘永逸等[14]研究表明经纯种乳酸菌发酵后的酸笋中亚硝酸盐含量较低，增加了产品的安全性和风味。

大量研究证实植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）具有高效降解亚硝酸盐的能力[15-19]。本研究采用一株植物乳杆菌对藠头进行低盐纯种发酵，以亚硝酸盐含量为评价指标，通过单因素试验和响应面试验探究接种量、食盐添加量、白糖添加量和发酵温度对发酵藠头产品品质的影响[20-24]，解决传统发酵高盐，品质、口感不一的问题，为纯种低盐发酵藠头的工业化生产提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：藠头、食盐、白糖、纯净水、白酒、小米椒、花椒、大蒜、老姜和干紫苏（市售）；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）（保藏于贵州大学酿酒与食品工程学院发酵工程与生物制药重点实验室）。

试剂：亚硝酸钠、95%乙醇、酚酞、乙酸锌、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、硼酸钠、冰乙酸、亚铁氰化钾、盐酸、氨水和硝酸等均为分析纯；MRS 琼脂培养基；MRS 肉汤培养基。

1.2 仪器与设备

FA1204B 型电子天平，上海天美天平仪器有限公司；SPX-250-Z 型生化培养箱，上海琅玕实验设备有限公司；TD5MD 型台式低速离心机，长沙迈佳森仪器设备公司；JYL-C020E 组织捣碎机，九阳股份有限公司；HH-6 数显型恒温水浴锅，常州澳SPX-250-Z型华仪器有限公司；722 型可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；SW-CJ-1FD 型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；YXQ-LS-75G 型立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

原料选择→清洗、整切→装瓶→加入配料→接菌种悬浮液→发酵→成品。

1.3.2 操作要点

（1）配料。纯净水500 mL、白酒12.5 mL、小米椒10 g、花椒2.5 g、大蒜7.5 g、老姜2.5 g、干紫苏1 g、食盐和白糖少量。

（2）菌种活化。从-80 ℃取出甘油管保藏的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）菌种，接种至MRS 培养基上，于30 ℃培养48 h，挑取单菌落接种至MRS 液体培养基中，于相同条件下培养18 ～20 h，以5%的接种量转接到MRS 液体培养基中培养18 h，于5 000 r·min-1离心5 min 后收集菌体，制备成菌体密度为4.88×106CFU·mL-1的种子液备用。

1.3.3 单因素试验

以菌种接种量5%、食盐添加量4%、白糖添加量4%、发酵温度30 ℃为基础，在工艺条件和其他影响指标相同的情况下，研究菌种接种量（2%、4%、6%、8%和10%）、食盐添加量（2%、4%、6%、8%和10%）、白糖添加量（2%、3%、4%、5%和6%）、发酵温度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃）对产品中亚硝酸盐含量的影响。

1.3.4 响应面试验

根据单因素试验结果，以亚硝酸盐含量为响应值，以菌种接种量（A）、白糖添加量（B）、食盐添加量（C）和发酵温度（D）为变量，采用Box-Behnken 展开4 个因素3 个水平的响应面试验，试验因素及水平设计见表1。

表1 因素水平表

1.3.5 理化检测

亚硝酸盐检测：依照《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》（GB 5009.33—2016）中第二法分光光度法。

1.3.6 数据处理

采用Design Expert 8.0.6 软件进行数据分析，采用Origin 2018 软件作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 接种量对藠头产品中亚硝酸盐含量的影响

由图1 可知，当接种量为8%时，亚硝酸盐含量最低，为0.137 mg·kg-1，因此选择最适接种量为8%。当接种量过小，会导致发酵时间过长，亚硝酸盐累积浓度过大；反之，发酵速度较快，菌株可在短时间内产生大量乳酸，可有效抑制杂菌生长的同时，增加产品的风味。

图1 菌种接种量对亚硝酸盐 含量的影响图

2.1.2 食盐添加量对藠头产品中亚硝酸盐含量的影响

由图2 可知，当食盐添加量在6%～8%时，亚硝酸盐含量呈线性增加，说明高盐发酵后的产品易出现亚硝酸盐的累积。当食盐添加量为6%时，亚硝酸含量最低，达0.488 mg·kg-1，因此选择最适食盐添加量为6%。

图2 食盐添加量对亚硝酸盐含量的影响图

2.1.3 白糖添加量对藠头产品中亚硝酸盐含量的影响

由图3 可知，当白糖添加量为3%时，亚硝酸盐的含量最低，为0.383 mg·kg-1，因此选择最适白糖添加量为3%。

图3 白糖添加量对亚硝酸盐含量的影响图

2.1.4 发酵温度对藠头产品中亚硝酸盐含量的影响

发酵温度会影响酶的活性，从而影响植物乳杆菌的生长和代谢活动[23-24]。发酵温度过低，植物乳杆菌受抑制，导致杂菌生长，造成污染，亚硝酸含量较高。由图4 可知，随着发酵温度的升高，亚硝酸盐含量呈先下降后上升再下降趋势，当发酵温度为30 ℃时，亚硝酸含量最低，为0.144 mg·kg-1，因此选择最适发酵温度为30 ℃。

图4 发酵温度对亚硝酸盐含量的影响图

2.2 响应面优化试验设计结果

以亚硝酸盐含量为响应值，在单因素试验基础上，选择A、B、C、D4 个因素，进行4 因素3 水平的响应面优化试验，以探究藠头发酵的最佳工艺参数。试验设计及结果如表2 所示，采用Design Expert 8.0.6 统计软件对数据进行回归分析，并对各因素进行多元拟合。回归方程如下所示。亚硝酸盐含量=0.30-0.12A-5.83×10-3B+0.052C-4.17×10-3D+0.023AB-7.5×10-3AC-0.13AD-0.015BC+0.030BD+0.092CD+0.100A2+0.021B2+0.052C2+0.098D2。

表2 响应面试验设计与结果表

由表3 的方差分析可知，该模型P＜0.01，回归模型差异极显著。失拟项P=0.633 7（P＞0.05），表明该模型具有统计学意义；方差分析中R2=0.952 2、试验结果表明模型拟合程度较好，适用于藠头发酵条件预测和分析。其中回归方程的一次项A、C对藠头的亚硝酸盐含量影响极显著，B、D不显著，且影响的顺序依次为A＞C＞B＞D，交互项AD、CD及二次项A2、C2、D2极显著，其余均不显著，这表明各个试验因素对亚硝酸盐含量的影响不是简单的线性关系。

表3 亚硝酸盐含量的方差分析结果表

两因素交互作用的响应面及等高线图见图5。由图5 可知，菌种接种量与白糖添加量、菌种接种量与食盐添加量、食盐添加量与白糖添加量、发酵温度与白糖添加量的等高线呈圆形，显示因素间交互作用不显著（P＞0.05），菌种接种量与发酵温度、发酵温度与食盐添加量的等高线呈椭圆形，显示因素间交互作用极显著（P＜0.01）。

图5 菌种接种量与3 个因素的交互作用对亚硝酸盐含量影响的响应面图

通过响应面试验结果并依据回归模型，得到以亚硝酸盐含量为响应值的最佳发酵工艺条件为菌种接种量8.86%，白糖添加量2.00%，食盐添加量4.24%，发酵温度35.00 ℃，预测亚硝酸盐最小值为0.20 mg·kg-1。为便于后续加工试验，选择最佳发酵工艺参数为菌种接种量9%，白糖添加量2%，食盐添加量4%，发酵温度35 ℃，在此条件下对所建模型进行验证，亚硝酸盐含量为0.196 mg·kg-1，验证值与预测值基本吻合，说明模型很好地模拟和预测了藠头发酵工艺。

3 结论

以亚硝酸盐含量为指标，选取菌种接种量、白糖添加量、食盐添加量、发酵温度进行单因素试验和响应值试验，得到藠头最佳发酵条件为菌种接种量9%、白糖添加量2%、食盐添加量4%、发酵温度35 ℃，在此条件下测得的亚硝酸盐含量为0.196 mg·kg-1，本研究为藠头纯种低盐发酵工艺提供了理论参考。