缺氧诱导因子HIF-1a通过上调Isthmin1促进结肠癌增殖的作用机制

刘云云,贾佩琦,于佩弘,周 欣,邵淑琳,苏东明

0 引 言

结肠癌(colon cancer, COAD)是世界范围内一种常见的胃肠道癌症,发病率和死亡率均保持上升趋势。据估计,2020年全球新发病例190万,死亡病例近93.5万［1］。中国癌症统计报告显示,我国结肠癌发病率、病死率在全部恶性肿瘤中分别位居第3及第5位,其中新发病例37.6万,死亡病例19.1万。多数患者在确诊时已属于中晚期。肝转移是导致患者死亡的主要原因［2］。

Isthmin1蛋白(Isthmin 1 protein, ISM1)是一种分泌蛋白,最早在非洲爪蟾的脑峡部被发现,在人类也有表达。ISM1在肺、脑、乳腺 、结肠等器官中富集［3］。虽然已有文献报道,ISM1可能参与细胞外基质的组织、细胞相互作用和血管生成［4］。然而,它对于结肠癌发生发展的作用机制和功能仍未被阐明。本研究首次观察了ISM1在结肠癌组织及细胞中的表达情况,探讨其与结肠癌患者临床特征的关系、其对结肠癌细胞生长的影响,以及调控ISM1表达的机制,以期筛选确定ISM1作为结肠癌病情评价的新靶点。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂人正常结肠上皮细胞NCM460和人结肠癌细胞系HCT116、HT29、SW480、SW620均购自美国ATCC细胞库,1640 RPMI、DMEM基础培养基和小牛血清均购自美国Gibco公司,蛋白酶体抑制剂和蛋白浓度测定试剂盒购自美国Invitrogen公司,HIF1A抗体和Tublin抗体均购自proteintech公司,ISM1抗体购自LifeSpan公司,Western blot二抗购自Thermo Fisher公司,慢病毒包装质粒购自吉凯公司。10例石蜡包埋结肠腺癌组织及癌旁正常组织取自南京医科大学第四附属医院。

1.2方法

1.2.1 ISM1在结肠癌组织中的表达前期使用TCGA数据库(https://tcga-data.nci.nih.gov),获取521例结肠癌患者的RNA-seq数据及相关临床数据,对ISM1在结肠癌中的表达以及结肠癌患者整体生存率的影响进行分析。

1.2.2免疫组织化学染色所有组织标本均采用4%浓度的甲醛溶液固定,常规石蜡包埋,4 μm切片。使用免疫组化染色试剂盒(PV-6000,北京中杉金桥)对结肠组织样本进行IHC染色。切片脱蜡、水化、修复抗原,洗涤后加入10%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶,孵育10 min,一抗孵育30 min,二抗孵育30 min,DAB染色。

1.2.3石蜡切片免疫荧光所有组织标本均采用10%中性缓冲福尔马林溶液固定,常规石蜡包埋,4 μm切片。烤片、脱蜡、水化、抗原修复、封闭同石蜡切片免疫组化,在37 ℃温度环境下一抗孵育2 h,PBS清洗,37 ℃温度避光二抗孵育1 h,PBS清洗,按1∶1000比例用PBS稀释DAPI,染核2 min,PBS清洗,抗荧光猝灭封片剂后置于载玻片上封固,用荧光显微镜下拍照。

1.2.4细胞培养及慢病毒感染细胞稳转株的构建人正常结肠上皮细胞HcoEpic、NCM460以及人结肠癌细胞系HCT116、HT29、SW480及SW620,使用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗的1640培养基进行培养,并置于含5% CO2的37 ℃细胞孵育箱中。每2 天更换1次培养液,并按1∶2比例每2天传代1次。

取皿中生长良好的人结肠癌HCT116细胞,胰酶消化后转入12孔板,保证每孔细胞密度在 50% 左右。待细胞贴壁后,慢病毒与培养基1∶1混合,加入培养皿中。72 h后,观察荧光转染效率,换含有嘌呤霉素的培养基对HCT116细胞进行筛选。筛选后的阳性细胞即可扩大培养,用于后期实验。Western blot检测感染效率。

1.2.5蛋白提取及Western blot检测用含1%蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞15 min,提取总蛋白。BCA定量蛋白浓度后,加入6x蛋白上样缓冲液于100 ℃水浴煮沸 10 min。通过SDS-PAGE电泳进行蛋白分离后,将蛋白湿转1.5 h至PVDF膜上;然后在室温下用5%的脱脂奶粉溶液封闭2 h;分别加入一抗4 ℃孵育过夜,TBST洗膜后在室温下二抗孵育1 h;TBST洗涤后加入超敏ECL曝光液,用凝胶成像系统进行分析。

1.2.6细胞增殖活性SRB实验分析将稳转株细胞HCT116-NC、HCT116-OE制成细胞悬液,进行细胞计数后,在96孔板中每孔加3000个细胞,每组设置6个复孔。分别在0、24、48、72、96 h收板,并用1%TCA进行细胞固定。固定4 h后,每孔加入50 μL SRB染液,室温静置染色15 min后进行洗脱,每孔加入100 μL 10 mmol/L Tris碱液(pH=10.5),震荡溶解10 min,用酶标仪检测波长490 nm处的吸光度值,记录结果。

1.2.7平板克隆形成实验用胰酶消化已感染的HCT116-NC、HCT116-OE稳转细胞,经过计数后,以500个/孔的密度接种至6孔细胞培养皿中,加入2 mL培养基,每隔2 d换1次液,连续培养14 d后,用4%多聚甲醛固定15 min,弃甲醛,PBS冲洗3遍,加入1 mL结晶紫染色10 min,PBS冲洗干净后,拍照并计数集落数量。

1.2.8结肠癌中ISM1表达量与结肠癌患者临床特征的相关性采用TCGA数据库获取521例结肠癌患者的相关临床数据,采用生存分析探究结肠癌中ISM1表达量与结肠癌患者临床特征的相关性。

1.2.9ISM1转录因子预测使用NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)获取ISM1的启动子序列,使用转录因子预测数据库JASPAR(https://jaspar.genereg.net/)对ISM1的启动子序列与缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)a结合位点进行预测。

1.2.10细胞缺氧诱导处理前1 d用完全培养基使HCT116细胞以5×105个/孔的密度接种于6孔板中。24 h后待细胞密度达70%～80%时,去血清,放入乏氧袋中,再放入一片配套规格的安宁包和一个氧气指示剂。封口放入培养箱中培养24 h后,从乏氧袋中取出,提取蛋白检测蛋白质表达。

1.3统计学分析所有实验均重复3次。采用Graphpad prism7软件及R语言进行统计学分析。计量资料数据两组间比较采用t检验;结肠癌中ISM1表达量与结肠癌患者临床特征的相关性采用在线生存分析工具Kaplan-Meier plotter(https://kmplot.com/analysis)分析。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ISM1在肠癌组织中的表达与定位数据库分析通过TCGA数据库中收录的泛癌数据集,比较了TCGA中所有33种癌症类型的肿瘤和邻近正常组织之间ISM1 mRNA的表达水平,结果发现ISM1在结肠癌、食道癌、子宫内膜癌等癌组织中的表达显著高于其相应的正常组织。在此基础上,对结肠癌组织中的非配对表达分析表明,ISM1在肿瘤组织(0.778±0.738,n=480)中的表达显著高于正常组织(0.441±0.293,n=41),差异有统计学意义(P=0.047)。对结肠癌组织中的配对差异分析显示,ISM1在肿瘤组织(0.826±0.702)中的表达显著高于其对应的正常组织(0.441±0.293),差异有统计学意义(P<0.01)。在TCGA队列中,One-way ANOVA的结果显示,在结肠癌不同病理学分期中,ISM1表达水平的差异具有统计学意义(P=0.008)。进一步比较不同临床病理特征患者中ISM1的表达,发现ISM1在晚期结肠癌中表达较高(P<0.05)。见图1。以上结果表明,ISM1在结肠癌组织中高表达,且与结肠癌患者预后不良相关,提示ISM1表达上调可能是造成结肠癌生长、侵袭和转移的原因之一。

*P<0.05、**P<0.01

2.2ISM1在人结肠癌组织中的表达和分布为了验证上述生物信息学的分析结果,对10例石蜡包埋结肠腺癌组织进行免疫组织化学染色后发现, ISM1在癌细胞中的表达显著高于癌旁组织,且ISM1主要在细胞质和间质中高表达,这与其作为分泌蛋白的作用一致,见图2。利用结肠癌冰冻切片进行荧光染色,标记ISM1的绿色荧光信号主要在细胞质和间质中,与免疫组化结果一致,见图3。Western blot方法分别检测正常结肠上皮细胞系HcoEpic和NCM460,以及3个结肠腺癌细胞系中ISM1的表达,结果表明, ISM1在3个结肠癌细胞系中的表达均高于2个正常结肠上皮细胞系,且在恶性程度最高的结肠癌细胞系SW620中表达最高(P<0.05)。见图4。

图 2 免疫组化染色观察ISM1在人结肠癌组织的表达与定位

图 3 ISM1在结肠癌组织中的免疫荧光染色定位

1-2:人正常结肠上皮细胞系; 3-5:人结肠癌细胞系

2.3ISM1促进结肠癌细胞的增殖分析选取结肠癌细胞系HT29,利用慢病毒载体构建ISM1过表达稳转株后,检测发现感染慢病毒后,HCT116结肠癌细胞系中ISM1的表达相较于对照组明显升高(P<0. 01),见图5,证明该ISM1过表达慢病毒具有良好的感染效率。对过表达ISM1后的HT29细胞分别进行SRB细胞增殖测定和克隆形成实验发现,从测量的第3天至第5天,与相应对照组相比,ISM1过表达的HT29细胞的增殖活性明显增强(P<0.05),见图6。通过平板克隆法进一步分析ISM1过表达对结肠癌细胞增殖能力的影响。与对照组相比,ISM1过表达能显著增强HT29细胞的克隆形成能力(P<0.05),见图7。

2.4结肠癌中ISM1表达量与结肠癌患者临床特征的相关性生存分析显示,ISM1的表达与结肠癌患者的整体生存期和疾病特异性生存期存在显著负相关(P<0.05),见图8,提示ISM1表达的上调可能是造成结肠癌患者总体生存期较短的原因之一。

1:对照组;2:过表达组

*P<0.05

a:对照组; b:过表达组

a:总生存率;b:疾病特异性生存率

2.5缺氧诱导因子HIF-1a对ISM1的转录调控作用免疫组织化学分析结果见图9。结果显示,缺氧诱导因子HIF-1a在结肠癌组织中的表达显著高于癌旁组织。使用转录因子预测数据库JASPAR对ISM1转录子的基因序列进行预测,发现ISM1转录启动位点上游2000 bp中含有3个HIF-1a结合位点,提示HIF-1a可能在转录水平调控ISM1的表达,见表1。为了验证这一推测,将结肠癌细胞系HCT116在缺氧袋中培养,见图10。显示厌氧培养显著上调ISM1的表达,提示ISM1在肿瘤内部缺氧的情况下可能受到HIF-1a的调控,导致ISM1表达增加,进而促进结肠癌细胞的增殖。

图 9 免疫组化染色分析HIF-1a在结肠癌组织中的表达和定位

表 1 HIF-1a可能在转录水平调控ISM1的表达

1-4:分别为缺氧0、12、24和48 h

3 讨 论

COAD是全球第三大因癌死亡原因。近年来,虽然外科手术和辅助性治疗手段取得了较大进展,但结肠癌患者的总生存率却无明显改善。因此,深入理解引起结肠癌发生发展的细胞与分子机制,对于其防治工作尤为重要［5］。

ISM1是一种分泌蛋白,也是胚胎和胎儿出生后发育的的重要因子［6］。ISM1 在哺乳动物的皮肤、内脏等组织器官中均有表达［3］。在本课题通过TCGA数据库检索发现,ISM1在乳腺癌、结肠癌、肺癌等恶性肿瘤组织中也有表达。而且,与相应的癌旁正常组织相比,ISM1在不同癌肿中的表达也存在上调或下调的趋势,提示ISM1在不同肿瘤中的生物学作用也不相同。有文献报道 ISM1的异常表达可以影响多种癌症的生物学行为。例如,lncRNAH19通过上调ISM1表达促进胃癌的发生和转移［7］。hsa_circ_0091570/miR1307则通过ISM1促进肝癌细胞的转移和侵袭［8］。Zheng等［9］曾报道在结肠癌细胞中miR-1307-3p通过抑制ISM1的表达参与细胞增殖和凋亡的过程。然而,ISM1在COAD中的临床意义及其他相关作用机制仍有待于进一步阐明。

为研究ISM1对结肠癌发生发展的影响,本研究首先使用生物信息学和免疫组织化学的方法分析了肿瘤组织与细胞中ISM1的表达情况。结果表明,与对照组相比,ISM1在结肠癌组织和细胞系中的表达明显升高。在结肠癌细胞系中,随癌细胞的恶性程度增强,ISM1的表达量也相应上调;其表达量与结肠癌患者的整体生存期和疾病特异性生存期存在着明显负相关性。这些结果表明ISM1可能作为一个促癌因子参与了结肠癌发生发展的调控。这一推论在我们后续生物学功能实验中得到了验证。我们利用结肠癌细胞系过表达ISM1之后,使用该细胞系进行CCK-8实验和细胞克隆形成实验来探索ISM1对结肠癌细胞增殖的影响［10］,发现ISM1表达上调可以明显促进结肠癌细胞的增殖能力。

由于生长迅速,癌症组织的肿瘤细胞往往处于缺氧状态［11］。缺氧会增强肿瘤细胞的恶性表型,对肿瘤的增殖迁移至关重要。HIF-1是1992年由Semenza和Wang首先发现。HIF-1普遍存在于人和哺乳动物细胞内,常氧下(21%O2)也有表达,但合成的HIF-1蛋白很快即被细胞内氧依赖性泛素蛋白酶降解途径所降解,只有在缺氧条件下HIF-1才可稳定表达［12］。HIF-1是具有转录活性的核蛋白,具有相当广泛的靶基因谱,其中包括与缺氧适应、炎症发展及肿瘤生长等相关的100多种靶基因。当其与靶基因结合后,通过转录和转录后调控使机体产生一系列病理反应,如低氧性肺动脉高压、肿瘤加速生长等［13］。在前述实验结果的基础上发现,缺氧培养的结肠癌细胞系中ISM1的表达显著上调。在本研究中,我们还首次在结肠癌组织中通过生物信息学方法揭示了缺氧刺激ism1基因表达的潜在机制。发现ism1基因转录启动位点上游存在多个HIF1α的结合位点。过表达HIF1α通过直接与ism1基因的保守调控元件结合,转录激活ism1基因的表达。

综上所述,本研究显示ISM1在结肠癌组织中的表达明显增高,与结肠癌患者的生存率存在着明显负相关性。本研究发现,ISM1在结肠癌细胞增殖过程中发挥重要作用。癌细胞中的HIF1α通过上调ISM1的转录水平,促进其表达。本研究的结果为进一步阐明ISM1对结肠癌的细胞生物学行为影响及其作用机制,为探索其在结肠癌的诊断和防治的作用奠定了基础。